ABO血型測序法對B(A）血型等位基因的檢測分析

張心怡,田曉豐,劉鐵梅

(1.長春市中心醫(yī)院輸血科,吉林長春 130051;2.吉林大學(xué)第二臨床學(xué)院;3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院）

1 材料與方法

1.1 樣本來源收集2010年在吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院輸血科30例健康獻(xiàn)血者EDTA抗凝全血(建立ABO基因測序法的可靠性）。2例健康體檢正反定型不符標(biāo)本(長春市中心血站提供）,系母子關(guān)系。

1.2 血型血清學(xué)檢測正定型試驗采用長春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)抗A、抗B血型定型試劑(單克隆抗體）;反定型試驗用上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)A、B、O紅細(xì)胞,生理鹽水及37℃水浴箱。應(yīng)用吸收放散技術(shù)證實弱的A或B抗原[3]。單克隆抗-H試劑檢測紅細(xì)胞上H抗原含量。

1.3 所有標(biāo)本用血清學(xué)方法檢測ABO血型后,采用鹽析法提取DNA。

1.4 ABO血型基因測序方法的建立每份標(biāo)本分別擴(kuò)增ABO血型基因第6和第7外顯子片段。引物序列如下:5'-CGGAATTCACTCGCCACTGCCTGGGTCTC-3',5'-CGGGATCCATGTGGGTGGCACCCTGCC-3'用于擴(kuò)增ABO血型基因的第6外顯子,擴(kuò)增產(chǎn)物為278 bp。引物 5'-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3',5'-CGGGATCCCCGTCCGCCTTGCAG-3',用于擴(kuò)增ABO血型基因的第7外顯子,擴(kuò)增產(chǎn)物為310 bp。內(nèi)對照為人類生長激素(HGH）基因特異性引物,HGH-A 鏈引物序列為:5'-TGCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3',HGH-B鏈引物序列為:5'-CCACTCACGGATTTCTGTTGTGTTTG-3',擴(kuò)增產(chǎn)物為434 bp。

1.5 PCR擴(kuò)增體系為50 μ l DNA Taq酶 0.5 u,10×PCR buffer:5 μ l,dNTP:1 mM,每條引物終濃度 1 μ M 和 DNA 2 μ g;循環(huán)參數(shù)為 94℃,5 min;94℃,30 s;60℃,30 s;72℃,50 s;30個循環(huán)后72℃,5 min結(jié)束擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工直接雙向通測。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)檢測結(jié)果30例健康獻(xiàn)血者ABO血型正反檢測結(jié)果均一致,此結(jié)果用于建立ABO基因測序的基礎(chǔ)。2例母子關(guān)系標(biāo)本的紅細(xì)胞與抗-B發(fā)生較強(qiáng)凝集(4+）;與抗-A發(fā)生弱凝集(1+）反定型血清中含有抗-A。紅細(xì)胞上H抗原含量接近O型細(xì)胞,明顯超過正常B型細(xì)胞上H抗原的含量;吸收放散試驗可檢出紅細(xì)胞上的A抗原,結(jié)果見表1。

表1 血清學(xué)檢測結(jié)果

2.2 ABO血型基因測序結(jié)果 30例正反定型結(jié)果一致的標(biāo)本測序結(jié)果也同血清學(xué)檢測結(jié)果,說明測序方法確立。2例母子關(guān)系標(biāo)本的測序結(jié)果均含有正常的O1等位基因,而他們的B等位基因均在正常B*101基因序列的基礎(chǔ)上存在單堿基突變803C→G,如測序圖1所示。

圖1 B血型基因測序結(jié)果圖

3 討論

B(A）型是罕見的ABO亞型,1985年發(fā)現(xiàn)其表型[4],紅細(xì)胞遺傳學(xué)上認(rèn)為是B型,紅細(xì)胞上有正常含量的B抗原和少量的A抗原,其血清中含有抗A。A型和B型血的cDNA有7處核苷酸不同。迄今發(fā)現(xiàn)的A基因796位為C,803位為G;B基因796位為A,803位為C[5]。2例母子血型基因測序結(jié)果796位為A,803位為G,很好得解釋了標(biāo)本與抗-A也有弱凝集,是因為這樣的人群在表達(dá)B糖基轉(zhuǎn)移酶時少量得合成了A血型物質(zhì)[5]。血清學(xué)檢測方法容易在特殊血型的診斷中出現(xiàn)誤判或結(jié)果不明確[6],或表現(xiàn)為ABO亞型[7]。我們利用分子生物學(xué)的方法直接對標(biāo)本測序就可以揭示其基因背景,也有可能發(fā)現(xiàn)新的基因多態(tài)性。對B(A）這樣血型的準(zhǔn)確、及時定型非常重要,只有準(zhǔn)確診斷才能為臨床安全輸血提供保證,避免發(fā)生醫(yī)療糾紛等。另外對血型中亞型的資料積累,能夠更好地解析血型遺傳規(guī)律,為人類學(xué)研究做出更多貢獻(xiàn)。

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