卒中后抑郁模型大鼠杏仁核神經元凋亡增加

劉 昊， 王海濤， 徐愛軍， 李世英， 張晉霞， 張 蕊

卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是腦卒中后引起的抑郁癥狀，是腦血管疾病常見并發癥，主要表現為興趣減退、易激惹、思維遲緩、食欲減退、悲觀絕望，甚至出現自殺企圖和行為等，嚴重影響患者神經功能康復和生存質量，增加患者死亡率。但PSD發病機制尚不明確。杏仁核涉及了抑郁行為、情緒或心境改變的過程［1］，在抑郁癥的病理機制中發揮重要作用［2］。研究表明，PSD患者存在海馬及杏仁核容積異?？s小［3］。影像學研究結果也表明抑郁患者杏仁核容積明顯小于對照組［4］。這提示在PSD發病過程中杏仁核部位存在細胞的異常死亡和丟失。凋亡是細胞程序性死亡方式之一，能導致細胞死亡和數量減少。在卒中后抑郁癥發病中杏仁核神經元是否存在異常凋亡目前尚未見相關報道。本實驗建立大鼠PSD模型，檢測杏仁核中是否存在神經元凋亡，為揭示卒中后抑郁癥發病機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠30只，體重230～250g(河北聯合大學實驗動物中心提供)。實驗前適應性飼養1w，飼養條件:22℃ ～25℃、晝夜節律(12/12h)、自由飲水攝食。

1.1.2 主要試劑 原位細胞凋亡檢測試劑盒(Roch公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及PSD模型建立 隨機將大鼠分為模型組和對照組，每組15只。采用復合造模法制備PSD大鼠模型，即先采用栓線法使大鼠大腦右側中動脈閉塞(MCAO)，制備大鼠卒中模型。術后單籠孤養。恢復飼養7d后，給予慢性不可預見的溫和應激28d建立 PSD模型。應激包括禁食(24h)、禁水(24h)、高溫環境(45℃)5min、晝夜顛倒24h、水平振蕩30min、冰水游泳(4℃)、夾尾1min等7種。每天隨機選取一種應激，相同應激不連續出現，每種應激出現4次。對照組除每天抓取1次外，不做其他處理。測量兩組大鼠在慢性應激的第1、8、15、22、29 天的體重情況。

1.2.2 行為學實驗 采用以下方法對大鼠進行行為學檢測。(1)糖水實驗:兩組大鼠在慢性應激的第1、8、15、22、29 天，每隔 1w 進行禁水 24h，第2天進行糖水消耗實驗，即測定禁水24h后第1小時內動物飲用1%蔗糖溶液的量。計算獲得相對糖水消耗量(糖水消耗/體重×100g)，取3次測試平均值作為糖水測試基礎值。(2)開場(open field test，OFT)測試:敞箱自制，長寬高分別為100cm、100cm、60cm，底部劃分為25個20cm×20cm方格。應激結束后進行測試，每次將一只大鼠放入敞箱中心方格內，開始計時并攝像記錄大鼠5min的自由活動情況。測試指標包括大鼠的水平運動行為(穿越的方格數目)和垂直運動行為(動物雙側前肢離開底面站立的次數)。(3)Morris水迷宮實驗:應激結束后次日開始利用Morris水迷宮測試其空間記憶成績。連續測試3d，每天5個循環，記錄其在60s內尋找平臺的時間，即逃避潛伏期(EL)。取3d的測試成績計為動物的空間記憶成績。

1.2.3 TUNEL檢測杏仁核神經元凋亡 兩組大鼠各取5只處死，快速取出腦組織，常規石蠟包埋，5μm切片。按照檢測試劑盒說明書進行TUNEL法原位末端標記DNA片段檢測杏仁核神經元凋亡。主要步驟:組織切片常規脫蠟至水，0.3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶活性，蛋白酶K消化，TdT反應液、anti-fluorescein antibody工作液37℃各作用1h，DAB顯色，蘇木素復染。不含TdT反應液的為陰性對照。每張玻片分別隨機取5個高倍鏡視野，計數陽性細胞數和細胞總數，計算陽性細胞率，陽性細胞率(%)=陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.2.4 流式細胞術檢測杏仁核神經元凋亡率(%) 兩組大鼠各取5只，麻醉后斷頭取腦。根據圖譜，在立體顯微鏡下分離右側杏仁核，置于預冷的PBS中，剪成小碎塊，0.25%胰酶37℃恒溫消化30min。200目篩網過濾后800r/min 4℃離心8min，棄上清，加入PBS液3ml懸浮細胞。重復操作一次，調整細胞濃度為5×105/ml ～1×106/ml。取1ml細胞懸液，1000r/min 4℃離心10min，棄上清，加入1ml預冷PBS，輕輕振蕩使細胞懸浮。重復操作3次。將細胞重懸于200μl Binding Buffer液中，加入10μl Annexin V-FITC 和5μl Propidium Iodide，輕輕混勻，避光室溫反應15min。加入300μl Binding Buffer液，上機檢測。

2 結果

2.1 體重增長 兩組大鼠體重變化(見圖1)。經過2w時間的應激后，模型組大鼠體重趨勢明顯減緩。

2.2 行為學結果

2.2.1 糖水偏好實驗結果 兩組大鼠相對糖水消耗量(見表1)。22d開始，模型組大鼠相對糖水消耗量較對照組顯著減少(P＜0.05)。

2.2.2 曠場實驗結果 兩組大鼠在曠場箱內主要在箱壁區域活動，其運動符合嚙齒類動物的趨觸性自然屬性，即嚙齒類動物趨向于沿壁活動。兩組大鼠5min內中央格停留時間、穿行格數、直立次數、修飾行為結果(見表2)?？梢娔Ｐ徒M大鼠中央格停留時間和直立次數顯著低于對照組，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

2.2.3 水迷宮結果 對照組與模型組大鼠平均逃避潛伏期分別為 5.632 ±1.065s、20.762 ±3.236s，兩組之間差異具有統計學意義(P＜0.01)。

2.3 TUNEL染色結果 光鏡下可見凋亡神經元胞核深染為棕黃色，非凋亡神經元胞核則呈藍色。對照組可見少量TUNEL陽性細胞，模型組TUNEL陽性細胞明顯增多。分析結果(見表3)，對照組和模型組凋亡神經元陽性率分別為3.91% ±0.49%和25.04% ±6.32%，差異有統計學意義(P ＜0.01)。

2.4 流式細胞術檢測結果 可見對照組和模型組神經元凋亡率分別為 3.50% ±0.5%和18.75% ±2.95%，差異具有統計學意義(P＜0.01)，結果(見表3)。

圖1 兩組大鼠體重變化，與對照組比較*P＜0.05，＊＊ P＜0.01

表1 兩組大鼠糖水消耗量變化 ± s，ml)

表1 兩組大鼠糖水消耗量變化 ± s，ml)

與對照組比較*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

對照組模型組13.3 ±2.113.4 ±1.612.9 ±2.114.5 ±1.713.8 ±3.013.2 ±1.714.1 ±2.312.0 ±1.615.9 ±2.711.5 ±1.1*19.1 ±3.310.6 ±2.1＊＊

表2 兩組大鼠曠場實驗結果(n=5，±s)

表2 兩組大鼠曠場實驗結果(n=5，±s)

與對照組比較*P＜0.05

對照組模型組13.75 ±0.575.00 ±0.82*39.50 ±4.2030.75 ±3.956.00 ±0.82*1.75 ±0.9612.25 ±2.069.75 ±1.26

表3 兩組大鼠TUNEL染色和流式細胞術結果(n=5±s)

表3 兩組大鼠TUNEL染色和流式細胞術結果(n=5±s)

對照組模型組3.91 ±0.4925.04 ±6.32＊＊3.50 ±0.5218.75 ±2.95＊＊

3 討論

PSD是腦卒中后引起的抑郁癥狀，是腦血管疾病常見并發癥。本研究中采用復合造模法制備PSD大鼠模型，即采用大腦中動脈線栓再灌注法制備局灶性腦缺血大鼠模型(模擬人類PSD發生的“原發性內源性機制”學說)。卒中大鼠神經缺損基本恢復后，相繼給予孤養和慢性不可預見性應激處理，現實地模擬卒中患者受到的生活應激事件和困難(模擬人類PSD發生的“反應性機制”學說)，從而誘導或加重PSD的發生。實驗結果表明，在造模過程中，模型動物處于明顯抑郁狀態，可見精神萎靡，毛色晦滯，體重減輕，各種活動減少，在規定的時間內水平活動和垂直活動次數減少，糖水消耗量降低，逃避潛伏期增加。提示大鼠可以模擬快感缺失、精神運動抑制、記憶力減退等臨床抑郁癥狀，具備較好的癥狀正確性，是一種較好的PSD動物模型。

抑郁癥并非完全是功能性的精神障礙，患者存在腦形態結構的改變。抑郁癥的異常部位可涉及部分額葉和顳葉以及與其相聯系的紋狀體、皮質和丘腦。作為邊緣系統的杏仁核與海馬更是共同參與了情感行為的形成、自主活動、內分泌整合等過程，在抑郁癥的發病機制中起著重要作用。PSD是腦血管疾病的主要并發癥，PSD較抑郁癥更存在器質性病變的基礎。對抑郁患者杏仁核的研究，結果均表明杏仁核存在神經元數量和體積明顯縮小［3，4］，提示杏仁核中存在異常的細胞死亡和丟失。凋亡(apoptosis)是一種程序性死亡方式，以細胞內caspase激活為起點，以細胞核濃縮、染色體DNA被以核小體為單位切成梯狀片段、細胞縮小、最終形成凋亡小體而不引起周圍細胞的溶解等形態變化為特征。本實驗結果顯示，卒中后抑郁大鼠杏仁核神經元出現明顯的凋亡現象。抑郁患者尸檢資料也表明，抑郁患者杏仁核中膠質細胞數目及密度明顯減少［5］?？梢姡尤屎瞬课患毎蛲隹赡芘c杏仁核體積異常有關。細胞凋亡是由基因控制的細胞程序性死亡過程，是機體生長發育、細胞分化、生理及病理性死亡的重要機制。細胞凋亡的調控主要有3條途徑:線粒體途徑、死亡受體途徑以及內質網途徑［6，7］。不同的死亡信號通過不同的途徑誘導細胞凋亡。PSD中杏仁核細胞凋亡的機制有待進一步深入開展。

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