PGPR植物促生菌ASP-15浸種效果初探*

吳皓瓊，牛彥波，殷 博，甄 濤

（黑龍江省科學院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010）

近10年來植物根圈促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)制劑越來越受到人們的青睞[1]。植物根圈促生菌是指自由生活在土壤或附生于植物根的一類可促進植物生長及其礦質營養(yǎng)的吸收和利用，并能抑制有害微生物的有益菌類。一般具有固氮、解磷、釋鉀、產(chǎn)生植物激素和分泌抗生素等能力或至少具有其中之一的能力。PGPR對土壤中有害病原微生物與非寄生性根際有害微生物都有生防作用，對植物吸收利用礦物質營養(yǎng)有促進作用，并可以產(chǎn)生有益于植物生長的代謝產(chǎn)物，從而促進植物的生長發(fā)育[2]。目前，有關植物促生菌PGPR的研究非常活躍，研究領域也非常廣泛，已從20多個種屬的根際細菌中鑒定出了具有防病促生潛能的PGPR菌，其中研究較多、較活躍的有假單孢菌屬（pseudomonas）和芽孢桿菌屬（bacillus）[3-5]。本項目組分離篩選的代號ASP-15產(chǎn)酸克雷伯氏（Klebsilla oxytoca）菌，兼具解磷、固氮及抑制病原真菌生長的功能，具有很好的應用潛力[6，7]，本文研究比較了其不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵液浸種對作物種子生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）

代號ASP-15,由本項目組分離、保藏。

1.1.2 試劑

常規(guī)化學試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器設備

電熱恒溫培養(yǎng)箱；干燥箱；空氣浴振蕩器；超凈工作臺（1級）；電子天平；數(shù)顯型酸度計；手提式蒸汽消毒器；顯微鏡等。

1.1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基配方采用肉湯培養(yǎng)基；搖瓶培養(yǎng)基配方采用糖蜜-玉米漿培養(yǎng)基(糖蜜15.0～20.0g，玉米漿 1.0～1.5g， 無 機 鹽 0.2g，H2O 1000mL)；30℃、150r/min空氣浴振蕩器培養(yǎng)24h，經(jīng)顯微鏡血球測定將活菌數(shù)調整在40×108～50×108cfu/mL間。

1.2 試驗方法

1.2.1 ASP-15不同稀釋倍數(shù)菌液浸種對種子發(fā)芽及生根的影響

在實驗室條件下,隨機選擇顆粒飽滿程度一致、健康的大豆、玉米、水稻種子，分組裝入小燒杯中，編號，種子表面用1%～2%的次氯酸鈉溶液進行消毒，清水沖洗干凈，分別以ASP-15菌不同稀釋倍數(shù)的菌液浸種。設5個處理：

處理1：ASP-15菌 原液浸種；

處理2：ASP-15菌 10倍稀釋液浸種；

處理3：ASP-15菌 100倍稀釋液浸種；

處理4：ASP-15菌 1000倍稀釋液浸種；

處理5：清水浸種（對照CK）。

每個處理3次重復，計150粒種子。大豆、水稻、玉米每個處理分別用4.5mL、1.0 mL、7.0 mL ASP-15菌不同稀釋倍數(shù)的菌液浸種30min，后用清水反復沖洗種子3次，分別置于鋪有濾紙的直徑9cm平皿中，25℃催芽48～96h，期間，適量補水使培養(yǎng)皿內濾紙保持微微潮濕狀態(tài)，避免因水分不足而影響種子的生長，觀察種子的發(fā)芽及生長狀況。

1.2.2 ASP-15最適宜稀釋倍數(shù)浸種效果

在1.2.1工作的基礎上，通過對各處理種子發(fā)芽率及根長的比較分析，確定ASP-15菌浸種的最適宜稀釋倍數(shù)。

選擇最適宜濃度的ASP-15菌液浸種，操作同

1.2.1 ,設2個處理:

處理1：ASP-15菌 100～1000倍稀釋液浸種；處理2：清水浸種（對照CK）。

每個處理3次重復，計150粒種子。觀察種子的48h、72h發(fā)芽率及72h生根情況,并計算每粒種子黏附菌數(shù)。

2 結果及分析

2.1 ASP-15菌液不同稀釋倍數(shù)浸種狀況分析

結果見表1。從表1可以看出：ASP-15菌對作物種子的“作用”是各不相同，應用于玉米和水稻種，不同稀釋倍數(shù)的ASP-15菌液都能或多或少地提高種子的發(fā)芽率及出芽時間，玉米種子浸種48h測定，處理組較清水對照組發(fā)芽率提高了12.87%～30.70%，其中100倍稀釋液表現(xiàn)最好，發(fā)芽率達88%，較對照提高30.7%；水稻種子浸種48h，發(fā)芽率提高了6.52%～28.02%，以1000倍稀釋液表現(xiàn)最好，發(fā)芽率達78.52%,較對照提高28.02%；應用于大豆種子，僅僅處理3明顯提高了大豆種子的發(fā)芽率，48h較清水對照比提高了142.8%，72h較清水對照比提高了24.4%,而其余處理較清水對照發(fā)芽明顯受到抑制,可能是ASP-15菌代謝產(chǎn)物高濃度狀態(tài)對大豆的生長有抑制作用的緣故。根據(jù)各處理種子發(fā)芽率及生長情況，可以確定對大豆、玉米種子來說，處理3即100倍稀釋液浸種效果最好；對水稻來說，處理4優(yōu)勢明顯，為最佳。

表1 ASP-15不同稀釋倍數(shù)菌液對作物種子發(fā)芽率的影響Table 1 Effect of seed germination rate by the different diluted times ASP-15 bacteria on fermented liquor

2.2 ASP-15最適宜稀釋倍數(shù)浸種效果分析

結果見表2。從表2可以看出：在實驗室條件下，100-1000倍ASP-15菌稀釋液浸種，能夠顯著提高大豆、玉米、水稻種子的發(fā)芽率，特別是在發(fā)芽初期尤為明顯。培養(yǎng)48h測定，玉米發(fā)芽率為86.8%，同對照比，發(fā)芽率提高了23.47%；大豆發(fā)芽率為68.9%，提高了34.83%；水稻發(fā)芽率為80.7%，提高了29.53%。ASP-15菌除提高種子發(fā)芽率外，對作物根也有刺激生長作用，經(jīng)ASP-15菌處理的種子，其根表現(xiàn)為粗而長，根毛多而密。對于大豆、玉米來說，用ASP-15菌100倍稀釋液浸種，培養(yǎng)72h，根長的測定結果表明：處理組根長分別達到36.57mm、38.86mm，比對照（清水）增加了48.48%、39.98%，差異極顯著（t值6.252、5.243）；對水稻來說，1000倍ASP-15菌稀釋液對水稻生根刺激作用明顯，培養(yǎng)72 h處理組平均根長為34.59mm，對照組20.86mm，處理較對照相比，根長增加65.82%，差異極顯著（t值15.106）。通過測定每毫升活菌數(shù)及各種子質量，可以得出每粒種子上吸附有ASP-15菌的個數(shù)。即大豆每粒種子至少吸附有3.6×106～4.5×106個菌、玉米每粒種子至少吸附有5.6×106～7.0×106個菌、水稻每粒種子至少吸附有8.0×104～1.0×105個菌時,ASP-15菌才能充分發(fā)揮作用(見表3)。

表2 ASP-15菌對作物種子的影響Table 2 Effect of the ASP-15 bacteria on seed

表3 每粒種子吸附ASP-15菌最低數(shù)量Table 3 The least number of the ASP-15 bacteria being absorbed into each seed

綜上所述，ASP-15菌作為活菌制劑，其功效是活菌體起關鍵作用，因此在應用于浸種時，每粒種子上必須吸附上適宜數(shù)量的活菌，才能通過微生物在根際的物質轉化和代謝產(chǎn)物不斷形成，起到營養(yǎng)、促生作用。在本實驗中，ASP-15菌活菌數(shù)為40×108～50×108cfu/mL時，對大豆、玉米種子來說，用100倍稀釋液效果最好，每粒種子沾有不少于1×106個菌；對水稻種子來說，用1000倍稀釋液浸種即可，每粒種子不少于1×105個菌，與大豆、玉米種相差一個數(shù)量級。說明應用微生物制劑時，必須考慮種子的吸附菌液的最適宜量，在充分進行實驗基礎上，才能確定微生物對哪些作物有作用、最佳劑量是多少，不能一概而論。

［1］戴梅，宮象輝，叢蕾，等.PGPR制劑研發(fā)現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢［J］.山東科學，2006,19(6)：45～47.

［2］劉淑琮，馮斷，于潔.植物根際促生菌的研究進展及其環(huán)境作用［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2009,48(11)：2882～2886.

［3］胡江春,薛德林,馬成新,等.植物根際促生菌(PGPR)的研究與應用前景［J］.應用生態(tài)學報,2004,15(10):1963～1966.

［4］趙爽,劉偉成,裘季燕,等.多粘類芽孢桿菌抗菌物質和防病機制之研究進展［J］.中國農(nóng)學通報,2008,24(7):347～350.

［5］張偉瓊,聶明,肖明.熒光假單胞菌生防機理的研究進展［J］.生物學志,2007,24(3):9～11.

［6］牛彥波，吳皓瓊.Klebsilla ASP-15拮抗真菌病害能力與抗病機理的初步研究［J］.生物技術，2009,19（3）：55～57.

［7］吳皓瓊，牛彥波，殷博，等.Klebsilla ASP-15根圈促生菌發(fā)酵工藝配方及復合菌株的性能研究［J］.黑龍江科學，2010,1（5）：8～10.