ATRA對甲狀腺鱗癌細胞株SW579細胞CDK4、CyclinD1、Rb 表達的影響

張秀梅，劉 超，閆紀亮，趙 頌，王翠瑤，肖建英

(遼寧醫學院，遼寧 錦州 121001)

目前研究表明，CyclinD1、CDK4表達異常及Rb蛋白的磷酸化狀態與多種惡性腫瘤的發生和發展有關［1］。我們以往的研究［2］表明，全反式維甲酸(ATRA)能夠抑制SW579細胞生長，并將細胞阻滯于G1期;同時在mRNA水平上調P21及RARβ的表達。P21及RARβ是否通過調控細胞周期相關蛋白CyclinD1、CDK4、Rb的表達水平從而阻滯細胞周期還不明確。我們于2009年10月～2010年8月進行本實驗，用ATRA處理甲狀腺鱗癌細胞株SW579，應用RT-PCR及Western blot方法檢測加入ATRA前后細胞周期因子CyclinD1、CDK4、pRb表達的變化，以期進一步了解ATRA抑制甲狀腺鱗癌細胞增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 ATRA、L15培養液、RT-PCR試劑盒(大連寶生物)、TRIzol試劑(Gibco BRL)、兔抗人CyclinD1、CDK4、Rb磷酸化多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶偶聯的IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司，PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)，Sunrise自動酶標檢測儀(瑞士TECAN公司)。

1.2 細胞培養與觀察 甲狀腺鱗癌細胞株SW579購自上海生命科學院細胞和生物化學研究所。培養于L15培養液中，飽和濕度、37℃、無CO2的條件下進行傳代培養。當細胞處于對數生長期時以105個/ml濃度接種于25 cm2的培養瓶，24 h后待細胞貼壁后給藥，使 ATRA 終濃度分別為 10－7、10－6、5×10－6、10－5mol/L，對照組加入 5 μl無水乙醇［乙醇濃度小于 0.1%(V/V)］。

1.3 半定量RT-PCR檢測CDK4、CyclinD1、Rb基因mRNA的表達 采用TRIzol一步法提取細胞總RNA。使用AMV逆轉錄酶合成cDNA第1鏈，在Taq酶的作用下進行PCR的擴增。CDK4的循環條件:94 ℃ 2 min、94 ℃變性30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min(30個循環)，72℃ 5 min;CyclinD1的循環條件:94 ℃ 2 min、94 ℃變性30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min(30個循環)，72℃ 5 min;Rb的循環條件:94℃2 min、94 ℃變性30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min(30 個循環)，72℃ 5 min;β-actin的循環條件:94℃ 2 min、94 ℃變性30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min(30 個循環)，72℃ 5 min。取PCR產物10 μl進行瓊脂糖凝膠電泳并拍照，應用凝膠圖像分析管理系統進行灰度測量，mRNA的表達水平以每一樣品與其內參βactin灰度比值表示。PCR引物序列及擴增片段長度如下:CDK4上游引物5'-TGATGCGCCAGTTTCTAAGAGG-3'，下游引物:5'-GGTCGGCTTCAGAGTTTCCACA-3'，擴增片段長度308 bp。CyclinD1上游引物:5'-GAAAGTAGGGACCTCAGAGG-3'，下游引物:5'-CTGTCCTCCCTCACACGTCA-3'，擴增片段長度 577 bp。Rb 上游引物:5'-TACCTAGCTCAAGGGTTAAT-3'，下游引物:5'-TAGCCATATGCACATGAATG-3'，擴增片段長度 300 bp。β-actin上游引物:5'-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3'，下游引物:5'-CAGGAGGAGCAATGATCTT-3'，擴增片段長度 384 bp。β-actin上游引物:5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3'，下游引物:5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3'，擴增片段長度661 bp。

1.4 Western blot檢測 CDK4、CyclinD1、pRb 蛋白的表達 用蛋白裂解液提取對數生長期細胞總蛋白，采用BCA蛋白測定試劑盒蛋白濃度。總蛋白－20℃或－80℃保存備用。電泳前加入SDS樣品緩沖液，100℃煮沸5 min，離心后上樣，10%SDS-PAGE電泳分離，然后將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，之后用含5%BSA的TBS(pH 7.4)將濾膜于室溫搖動溫育2 h進行封閉，封閉后的濾膜再分別與CyclinD1、CDK4、pRb磷酸化抗體(稀釋比為1∶200)4℃溫育過夜。經TTBS洗滌后，辣根過氧化物酶偶聯的IgG作為二抗(稀釋比為1∶5000)室溫溫育2 h，洗膜后使用ECL發光法顯色，內參采用β-actin。掃描X光片，計算機軟件處理，進行密度分析，計算灰度值。

1.5 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件，各組數據以表示，多樣本均數檢驗采用方差分析，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ATRA 對 SW579 細胞 CDK4、CyclinD1、Rb 基因mRNA表達的影響 與空白對照組比較，ATRA組在一定濃度(10－7～10－5mol/L)范圍內隨著藥物濃度的增加，CyclinD1 mRNA表達水平逐漸下降，且呈劑量依賴性(P ＜0.05)，但 CDK4、Rb mRNA 表達水平沒有明顯變化，見表1、圖1～3。2.2 ATRA 對 SW579 細胞 CDK4、CyclinD1、pRb 蛋白表達的影響 與對照組比較，ATRA組在一定濃度(10－7～10－5mol/L)范圍內，隨著藥物濃度的增加，CyclinD1蛋白表達水平、Rb蛋白的磷酸化水平逐漸下降，且呈劑量依賴性(P＜0.05)，但CDK4蛋白表達水平沒有明顯變化，見表2、圖4。

表 1 CDK4、CyclinD1、Rb mRNA 的表達水平(，n=3)

表 1 CDK4、CyclinD1、Rb mRNA 的表達水平(，n=3)

組別 CDK4/β-actin CyclinD1/β-actin Rb/β-actin空白對照組0.381 ±0.021 0.574 ±0.072 0.202 ±0.022乙醇對照組 0.376 ±0.023 0.563 ±0.028 0.203 ±0.034 ATRA組(mol/L)10 －7 0.372 ±0.027 0.437 ±0.011 0.205 ±0.05410 －6 0.363 ±0.018 0.335 ±0.025 0.196 ±0.0395 ×10 －6 0.376 ±0.051 0.228 ±0.034 0.208 ±0.04210－50.385 ±0.046 0.115 ±0.015 0.211 ±0.023

表 2 CDK4、CyclinD1、pRb 蛋白的表達水平(，n=3)

表 2 CDK4、CyclinD1、pRb 蛋白的表達水平(，n=3)

組別 CDK4/β-actin CyclinD1/β-actin pRb/β-actin空白對照組0.398 ±0.076 0.582 ±0.089 0.653 ±0.016 ATRA組(mol/L)10 －7 0.343 ±0.051 0.411 ±0.023 0.492 ±0.06410 －6 0.331 ±0.075 0.336 ±0.045 0.396 ±0.0955 ×10 －6 0.343 ±0.026 0.248 ±0.018 0.287 ±0.03610－50.332 ±0.069 0.151 ±0.045 0.162 ±0.045

圖4 Western blot檢測細胞周期相關蛋白表達

3 討論

本實驗中，ATRA在mRNA和蛋白水平都下調了SW579細胞CyclinD1的表達，并呈劑量依賴性，該結果與文獻報道［3～5］相一致。提示 ATRA抑制SW579細胞增殖與其下調CyclinD1的表達有關。

Rb是一個抑癌基因，非磷酸化(或低磷酸化)形式為活性型，能促進細胞分化，抑制細胞增殖。Rb蛋白的磷酸化程度與細胞周期密切相關，Rb蛋白通過結合或釋放轉錄因子E2F來控制檢測點進而控制細胞周期。E2F是一類激活轉錄作用的活性蛋白，控制著S期的重要蛋白質(包括DNA合成酶)的合成。低磷酸化的Rb蛋白與E2F結合，使E2F處于非活化狀態，從而抑制相關蛋白質的合成，抑制細胞分裂;高磷酸化的Rb蛋白釋放E2F，促使細胞進入細胞周期。有研究表明，ATRA能夠降低胃癌細胞株 BGC-823、SGC-7901、MKN-45 Rb蛋白的磷酸化水平［6］，在MEPM細胞中，ATRA能夠下調Rb蛋白的磷酸化水平，并降低CyclinD1、E蛋白的表達［7］。本研究證實，ATRA在一定濃度范圍內下調甲狀腺鱗癌SW579細胞Rb蛋白的磷酸化水平，與文獻報道相一致。提示ATRA抑制SW579細胞增殖與下調Rb蛋白的磷酸化水平有關。Yu等［8］研究證實ATRA抑制MEPM細胞增殖，下調 CyclinD1、Rb蛋白的磷酸化水平，依賴于P21的表達，并需要維甲酸受體的參與，支持我們的結果［2］。

綜合以往研究，我們認為ATRA抑制SW579細胞增殖的機制可能是通過高表達的RARβ與P21啟動子上的維甲酸反應元件結合，促進P21的表達。P21下調了CyclinD1的表達，抑制CDK4的活性，從而使Rb蛋白的磷酸化水平降低，低磷酸化的Rb蛋白與E2F結合，使E2F處于非活化狀態，從而抑制相關蛋白質的合成，抑制細胞分裂，將細胞阻滯于G1期，從而抑制SW579細胞的增殖。這種抑制機制是否也存在于其他甲狀腺癌細胞中，本研究室還在進一步研究中。

［1］付錦艷，潘曉琳，楊安強.細胞周期調控相關蛋白 Cyclin D1、CDK4和pRb在新疆維吾爾族婦女宮頸癌中的表達及意義［J］.腫瘤防治研究，2009，36(11):969-972.

［2］肖建英，李男，張秀梅，等.ATRA對甲狀腺鱗癌細胞生長及RARβ 和p21mRNA 表達的影響［J］.腫瘤防治研究，2010，37(7):759-762.

［3］Chang Q，Chen Z，You J，et al.All-trans-retinoic acid induces cell growth arrest in a human medulloblastoma cell line［J］.J Neurooncol，2007，84(3):263-267.

［4］Jia X，Liu B，Shi X，et al.Inhibition of benzo(a)pyrene-induced cell cycle progression by all-trans retinoic acid partly through cyclin D1/E2F-1 pathway in human embryo lung fibroblasts［J］.Cell Biol Int，2006，30(2):183-189.

［5］Huang M，Liu W，Li C，et al.The effect of sodium butyrate in combination with ATRA on the proliferation/differentiation of SKM-1 ［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2004，24(4):334-337.

［6］Wu Q，Chen Z，Su W.Growth inhibition of gastric cancer cells by all-trans retinoic acid through arresting cell cycle progression ［J］.Chin Med J(Engl)，2001，114(9):958-961.

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［8］Yu Z，Li W，Lu Q，et al.p21 is required for atRA-mediated growth inhibition of MEPM cells，which involves RAR ［J］.J Cell Biochem，2008，104(6):2185-2192.