Cbl-b shRNA穩定轉染乳腺癌MDA-MB-231細胞系的構建

張凌云，石 晶，滕月娥，張 曄，曲秀娟，劉云鵬

(中國醫科大學附屬第一醫院，沈陽 110001)

Cbl是在哺乳類動物體內廣泛分布的細胞內蛋白，有C-Cbl、Cbl-b和 Cbl-c 3種。Cbl家族分子中含有多個不同的結構域，可以介導不同的細胞內分子結合，在細胞活化過程中可作為接頭分子或支架分子參與信號轉導;同時該分子中的RING finger結構域能夠與泛素結合酶 E2結合，作為泛素連接酶E3促進其結合的靶分子發生泛素—蛋白酶體降解，因此參與細胞內信號轉導的負調控機制［1，2］。近年來許多研究表明，Cbl家族RING finger結構域突變與腫瘤的發生及發展相關［3～6］，但 Cbl家族分子對腫瘤細胞生長、遷移及多藥耐藥等方面的調控作用及分子機制尚不清楚。2010年6月～2011年4月我們進行本研究，擬構建靶向Cbl-b基因的短發夾環RNA(shRNA)真核質粒表達載體，建立 Cbl-b shRNA穩定轉染人乳腺癌MDA-MB-231細胞系，為探討Cbl-b的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞 人乳腺癌MDA-MB-231細胞生長于含10%胎牛血清、12 U/ml慶大霉素的L-15培養基(Gibco)中。于37℃、飽和濕度的培養箱內培養。大腸桿菌菌株DH5α由本實驗室保存。

1.2 試劑與抗體 轉染試劑LipofectamineTM2000購于 Invitrogen公司;dNTP、dATP、pyrobest高保真聚合酶、各種限制性內切酶、T4連接酶、DL2000 DNA Marker購自Takara公司;質粒提取和DNA回收試劑盒由Qiagen公司提供;抗Cbl-b抗體、抗Actin抗體及HRP標記的羊抗鼠、兔二抗均購于Santa Cruz Biotechnology公司。測序服務由Takara公司提供。

1.3 方法

1.3.1 引物設計與合成 根據Cbl-b基因序列，通過軟件設計兩個靶序列，利用BLAST進行同源性分析，設計出1組Cbl-b shRNA序列及1組對照靶序列。引物序列Cbl-b(852 bp):5'-GATCCCGTTTCCGGTTAAGTTGCACTCGTTCAAGAGACGAGTGCAACTTAACCGGAAATTTTTTCCAAA-3'及5'-AGCTTTTGGAAAAAATTTCCGGTTAAGTTGCACTCGTCTCTTGAACGAGTGCAACTTAACCGGAAAGG-3'，引物序列空白對照:5'-GATCCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTGATATCCGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTCCAAA-3'及5'-AGCTTTTGGAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCGGATATCZAACGTGACACGTTCGGAGAACGG-3'。shRNA排列順序均為:BamHⅠ酶切位點+反義序列+loop+正義序列+TC+HindⅢ和BamHⅠ酶切位點+正義序列+loop+反義序列+AG+HindⅢ。

1.3.2 構建靶向Cbl-b基因的shRNA真核質粒表達載體 選用pRNA-U6.1/Neo作為載體。化學合成法合成shRNA序列，將配對的單鏈合成雙鏈，采用Bam-HⅠ/HindⅢ限制性內切酶進行酶切后，以T4連接酶連接于同樣經過采用Bam-HⅠ/HindⅢ限制性內切酶進行酶切后的pRNA-U6.1/Neo載體內。將構建成的表達質粒轉化至感受態菌DH5α中，將菌液涂布于含有氨芐青霉素的LB平板，篩選陽性菌落。對構建完畢的質粒進行DNA測序，測序確認后進行大量復制、擴增并提取重組質粒。

1.3.3 基因轉染 用含10%胎牛血清的L-15培養基培養MDA-MB-231乳腺癌細胞。將對數生長期的細胞于轉染前24 h，按5×105/孔的密度接種于6孔培養板，當細胞達85% ～95%時按Lipofectamine 2000說明書進行脂質法轉染空質粒和重組表達質粒。轉染后48 h換為含G418(2 mg/ml)、10%胎牛血清的L-15培養液，每2～3 d換液。有限稀釋法篩選2周后抗性克隆集落長出，挑取單克隆集落進行擴大培養。

1.3.4 Western Blot檢測轉染后細胞中Cbl-b的表達 收集轉染后細胞進行裂解，提取細胞蛋白，取40 μg處理后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳并電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶封閉1 h，一抗孵育1 h，TBST洗膜后二抗孵育30 min，TBST洗膜后加入ECL發光液，孵育5 min，暗室中用X片曝光、顯影、定影。以未轉染細胞系和轉染對照質粒的細胞系作為對照，選取表達率為對照組10%以下的細胞株為陽性細胞株。

2 結果

2.1 靶向Cbl-b基因shRNA真核質粒表達載體的鑒定 將DNA測序結果和GenBank公布的人Cbl-b序列比對，結果顯示Cbl-b shRNA和空白對照模板成功構建于 pRNA-U6.1/Neo載體上，序列完全正確，與目的序列相同。

2.2 空白對照組和Cbl-b基因沉默乳腺癌MDAMB-231細胞系篩選 Western blot結果表明在27株陽性克隆MDA-MB-231/Cbl-b shRNA細胞中，7、9、18號克隆細胞株Cbl-b表達水平明顯低于空載體對照組，且18號克隆表達最低。Cbl-b基因沉默細胞系建系成功。見圖1。

圖1 Western blot檢測Cbl-b表達

3 討論

泛素—蛋白酶體途徑介導的蛋白降解是機體調節細胞內蛋白水平與功能的一個重要機制。最近研究發現，泛素—蛋白酶體途徑與腫瘤相關性脫調控有關，參與腫瘤轉化、腫瘤進展、免疫監控逃逸及抗藥性等真核細胞的許多代謝過程［4，5］。在此過程中需要3種酶的參與，即泛素激活酶E1、泛素結合酶E2和泛素連接酶E3。Cbl家族是泛素—蛋白酶體通路中的一種泛素連接酶E3，成員包括C-Cbl、Cbl-b和Cbl-c，可通過特異性選擇底物蛋白，啟動泛素化降解途徑而參與細胞內信號轉導的負向調控。其中C-Cbl與Cbl-b結構上具有79%的同源性，功能相似。C-Cbl及Cbl分子中含有多個不同的結構域，可以介導細胞內不同的分子結合，靶向降解以EGFR為代表的一系列具有酪氨酸激酶活性的受體蛋白，在維持機體穩態中發揮重要作用。目前 Cbl-b 已知的靶蛋白有 c-kit、EGFR、c-met、syk、Lyn、Grb2、P85 等［1，6］。但關于 Cbl-b 在腫瘤增殖、轉移、耐藥等方面的研究很少，因此需要進一步深入研究Cbl-b對腫瘤細胞信號轉導的調控機制。

目前RNA干擾(RNAi)技術已經發展為高效、特異阻斷細胞內目的基因表達的有效工具。與其他制備siRNA的方法，如體外轉錄法、化學合成法等比較，真核干擾表達載體既經濟高效又可以進行長期穩定的研究。本研究用脂質體法將構建的Cbl-b基因干擾質粒轉染MDA-MB-231乳腺癌細胞，通過G418篩選，獲得穩定表達干擾質粒的細胞株。該細胞系的建立為首次報道，這為我們進一步研究Cbl-b對乳腺腫瘤細胞生長、遷移等的影響，探討腫瘤治療的新思路奠定了基礎。

［1］Thien CB，Langdon WY.c-Cbl and Cbl-b ubiquitin ligases:substrate diversity and the negative regulation of signalling responses［J］.Biochem J，2005，391(2):153-166.

［2］Huang F，Gu H.Negative regulation of lymphocyte development and function by the Cbl family of proteins［J］.Immunol Rev，2008，224:229-238.

［3］Makishima H，Cazzolli H，Szpurka H，et al.Mutations of E3 ubiquitin ligase Cbl family members constitute a novel common pathogenic lesion in myeloid malignancies［J］.J Clin Oncol，2009，27(36):6109-6116.

［4］Qu X，Liu Y，Ma Y，et al.Up-regulation of the Cbl family of ubiquitin ligases is involved in ATRA and bufalin-induced cell adhesion but not cell differentiation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，367(1):183-189.

［5］Zhang Y，Qu X，Hu X，et al.Reversal of P-glycoprotein-mediated multi-drug resistance by the E3 ubiquitin ligase Cbl-b in human gastric adenocarcinoma cells［J］.J Pathol，2009，218(2):248-255.

［6］Huang C.Roles of E3 ubiquitin ligases in cell adhesion and migration［J］.Cell Adh Migr，2010，4(1):10-18.