胰島破壞大鼠模型的血糖變化

文曉紅，張仁東，郭 洋，趙圓宇，王亞平，代小思*

(1川北醫學院基礎醫學院，四川 南充 637007;2重慶醫科大學)

目前，在用鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病動物模型的研究中，大劑量STZ一次性注射后，對成模動物胰島的形態學觀察研究較多，而形態定量研究較少。2007年3月～2009年12月，本實驗采用體視學形態定量研究方法，觀察了STZ對大鼠胰島的破壞情況，并探討了胰島破壞與血糖的關系，為STZ致糖尿病動物模型的研究提供更多的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 健康雄性SD大鼠46只，10～12周齡，體質量280～320 g，由四川省醫學科學院實驗動物研究所提供。STZ，瑞士ALEXIS公司;Onetouch SureStep微血糖測量儀，中國強生醫療器材有限公司;穩步醫院用血糖試紙，美國LifeScan Inc;Rat/Mouse Insulin ELISA Kit，美國 LINCO Research;羥乙基甲基丙烯酸樹脂，德國Heraeus Kulzer公司;Olympus BX50型生物顯微鏡，日本Olympus公司;體視學圖像系統，川北醫學院與北京馳馬特圖像技術有限公司及四川大學聯合研制。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備 將46只大鼠隨機分為對照組10只、實驗組36只，自由攝取水和大鼠標準顆粒飼料。將780 mg STZ用0.1 mol/L的枸櫞酸—枸櫞酸鈉緩沖液(pH 4.2)65 ml溶解。在不禁食的條件下，實驗組按60 mg/kg一次性腹腔內注射STZ;對照組一次性腹腔內注射等量的枸櫞酸—枸櫞酸鈉緩沖液。注射STZ后第7天血糖達成模標準(血糖 ＞11.1 mmol/L［1］)的大鼠(高血糖組)有 19只，未成模大鼠10只，死亡7只。至第84天取材時，對照組有9只、高血糖組有7只、未成模大鼠有10只成活;又根據各周血糖情況，將未成模大鼠分為血糖部分正常組(5只)和血糖正常組(5只)。

1.2.2 檢測指標 在注射藥物后的第7、14、28、42、56、84天，禁食、禁水7 h后測空腹血糖;然后從對照組輪流抽取4～5只動物，從實驗組抽取所有空腹血糖＜10 mmol/L的動物進行腹腔葡萄糖耐量試驗(IPGTT)，即腹腔內注射葡萄糖(濃度50%，注射量2 g/kg)，30、60、120 min 后測量血糖，如果葡萄糖注射后120 min血糖值大于對照組的測量值，且≥10 mmol/L，則為IPGTT異常。在第84天，取血并分離血清，檢測血清胰島素(ELISA法，操作嚴格按試劑說明書進行，用Anthos2010酶標儀采用雙波長測OD值，根據試劑說明給定的標準曲線計算出相對應的濃度值)。

1.2.3 形態學觀察與形態定量 在注射后的第84天處死大鼠，取出胰腺置Bouin液內浸潤固定，70%乙醇脫水后，行組織塊等距隨機抽樣(每個胰腺共抽選8個組織塊);每2個組織塊放入一個包埋盒中用樹脂包埋;從每個包埋塊間隔切取10 μm厚的切片，共3張;選取第1張和第3張切片進行PAS及蘇木精染色。每個胰腺共得8張切片。使用Olympus BX50型生物顯微鏡和體視學圖像系統，在10×和20×物鏡、10×目鏡下觀察整張切片，記錄胰島的形態特征以及胰島內細胞核的多少、形態、大小和染色的深淺情況。用體視學方法測量以下指標:①胰島平均面積:計數胰島的總個數，并在圖像上隨機疊加9×13(即每行13個測點，共9行;或每列9個測點，共13列)規則排列的117個測點(點間距30 μm×30 μm)，計數位于胰島內的總測點數。胰島內的總測點數乘以每一測點所關聯的測面面積(30 μm×30 μm)，就是胰島總面積的估計。胰島的總面積除以胰島的總個數即得胰島的平均面積。②胰腺總面積:用關聯方測格(每一測點所關聯的測面面積為10 mm×10 mm，放大倍數為7.5倍)，計數位于胰腺組織內總測點數，將胰腺的總測點數乘以(10/7.5×10/7.5)mm2，就是胰腺總面積的估計。③單位面積胰腺內的胰島數量(NA):胰島的總個數除以胰腺的總面積即得單位面積胰腺內的胰島數量。④胰島體積分數:胰島的總面積除以胰腺的總面積即得胰島的體積分數(胰腺內胰島的體積比例)。⑤胰島總體積:胰腺的體積(胰腺的質量除以胰腺密度1.021，胰腺的密度用已知密度因而已知比重的乙醇溶液測得)乘以胰島的體積分數即胰島的總體積。

1.3 統計學方法 采用Sigma Stat 1.0統計軟件，數據以表示，組間比較采用單因素方差分析方法，數據方差齊性并符合正態分布時采用Student-Newman-Keuls檢驗，數據方差不齊或/和不符合正態分布時，同時用秩方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 空腹血糖、IPGTT、血清胰島素及胰島的形態定量 各組大鼠血糖范圍:14.9 mmol/L≤高血糖組血糖≤27.8 mmol/L，3.6 mmol/L≤血糖部分正常組血糖≤27.8 mmol/L，4.5 mmol/L≤血糖正常組血糖≤7.9 mmol/L。對照組IPGTT均正常;血糖正常組有2只IPGTT正常，3只異常;血糖部分正常組IPGTT均異常。見表1。

2.2 胰島的形態學變化 對照組胰島多為圓形或橢圓形的細胞團，界限清楚，數量較多;胰島內細胞數量較多。高血糖組胰島數量明顯減少，形態不規則;胰島內細胞數量減少，核的形態和大小不均一，部分胰島內細胞核較密集，染色較深。血糖正常組與血糖部分正常組有的胰島似對照組胰島的形態結構，有的胰島似高血糖組胰島的形態結構。

3 討論

本實驗表明，給大鼠一次性注射大劑量 STZ后，第7天血糖達成模標準的大鼠(高血糖組)的血糖波動在高血糖水平(14.9～27.8 mmol/L)，且未見轉復，這與于德民等［2～4］研究的報道一致，但未發現其血糖隨病程的延長而有所提高［4］或有自發性緩解的現象［5］;與對照組比較，成模大鼠胰島的平均面積、單位面積胰腺內胰島數量和胰島的總體積分別減少了 64.3%、68.2% 和 91.3%(P 均 ＜0.05);血清胰島素比對照組減少了92.6%，但無統計學差異。以上說明成模大鼠的胰島已受到嚴重破壞，β細胞分泌胰島素的功能明顯降低，且胰島破壞后不會自行恢復。

表1 對照組與實驗組的血糖、血清胰島素和形態定量結果()

表1 對照組與實驗組的血糖、血清胰島素和形態定量結果()

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與血糖正常組比較，#P ＜0.05;與血糖異常組比較，△P ＜0.05

組別 n血糖水平(mmol/L)注射前 注射7 d 注射14 d 注射28 d 注射42 d 注射56 d 注射84 d對照組 10 5.49 ±0.83 5.43 ±0.47 5.59 ±0.37 5.88 ±0.49 5.50 ±0.45 6.02 ±1.08 4.84 ±0.43血糖正常組 5 5.22 ±0.75 5.34 ±0.46 5.90 ±0.65 5.90 ±1.35 5.98 ±1.11 6.30 ±1.21 5.50 ±0.85血糖部分正常組 5 5.74 ±0.55 9.74 ±5.76 14.72 ±5.86*# 6.62 ±4.01 12.74 ±8.24*# 20.92 ±2.94*# 20.00 ±4.67*#高血糖組 19 5.61 ±0.36 19.74 ±3.28*#△ 22.60 ±4.43*#△ 22.11 ±1.73*#△ 23.20 ±2.73*#△ 23.11 ±3.00*# 22.10 ±2.68*#組別 n 胰腺體積(ml3) 胰島體積分數(%) 胰島總體積(μl3)胰島平均面積(mm2) NA(個/cm2) 血清胰島素(ng/ml)對照組 10 2.17 ±0.17 0.469 ±0.141 10.3 ±3.5 0.014 ±0.003 34.6 ± 7.8 1.49 ±2.12血糖正常組 5 1.69 ±0.20* 0.526 ±0.301 8.9 ±5.1 0.013 ±0.003 40.7 ±19.0 1.07 ±0.81血糖部分正常組 5 2.03 ±0.28# 0.071 ±0.043*# 1.4 ±0.9*# 0.007 ±0.003*# 9.5 ± 4.2*# 0.09 ±0.03*#高血糖組 19 1.75 ±0.15＊△ 0.053 ±0.015*# 0.9 ±0.3*# 0.005 ±0.001*# 11.0 ± 5.7*#0.11 ±0.03

第7天血糖未達成模標準的大鼠可分為血糖正常組和血糖部分正常組，本實驗特別針對未成模大鼠進行了較系統的研究，這是本文的新穎之處。血糖正常組的血糖、血清胰島素和胰島總體積與對照組比較均無統計學差異，但部分動物IPGTT異常;該組大部分胰島似對照組胰島的形態結構，小部分胰島似高血糖組胰島的形態結構。血糖部分正常組的IPGTT均異常，56 d和84 d的血糖與對照組比較，分別升高了 247.2%和 313.2%(P 均 ＜0.05)，而與高血糖組比較，無統計學差異;血清胰島素、胰島總體積比對照組也分別減少了94.0%、86.4%(P均＜0.05)，而與高血糖組無統計學差異;該組大部分胰島似高血糖組胰島的形態結構，小部分胰島似對照組胰島的形態結構，這與黃波等［4］報道的未成模動物胰島的形態結構類似于正常對照組不完全相同。以上說明未成模大鼠的胰島也受到不同程度的破壞，雖然開始未引起高血糖，但已導致糖耐量減低，以后部分大鼠(血糖部分正常組)血糖達成模標準，且未見轉復，故我們認為，這部分未成模大鼠(血糖部分正常組)也可作為1型糖尿病模型。鑒于胰島素抵抗與胰島β細胞功能受損是2型糖尿病發病機制中的兩個重要因素［6］，有不少研究先以小劑量(如25～30 mg/kg)STZ損傷大鼠胰島β細胞，2～3周后造成糖耐量異常，然后喂以高糖高脂肪飼料來建立類似人類2型糖尿病的動物模型［7］。在用這種方法建立2型糖尿病動物模型的研究中，需要血糖不高但糖耐量有異常的動物。本實驗顯示，部分大劑量STZ未成模大鼠(血糖正常組)已有糖耐量異常，但血糖一直不高，故我們設想，如果用這部分大鼠(血糖正常組)配合高糖高脂飼料來建立2型糖尿病的動物模型，不僅在造模上可能更可靠、快速，而且還可將未達到1型糖尿病動物模型成模標準的動物利用起來，從而節約研究費用，對于這一方法的確立尚需進一步的研究和探討。

目前，對胰島的形態定量研究多用胰島的體積分數［8］或相對體積［9］，而胰島總體積是一絕對參數，絕對參數一般比相對參數更有比較價值，更有說服力，故胰島總體積是研究胰島破壞程度的重要指標;另外，對胰島形態定量研究過程中的具體做法，如怎樣取胰腺、抽樣的大小以及如何計數等方面的報道尚不夠詳細。本實驗是從整個胰腺隨機切取組織塊，且組織塊多，切片也多;根據整個胰腺切片的總面積和整個胰腺切片內胰島輪廓的總面積估計胰島的體積分數，且還估計了胰島總體積，這也是本文的新穎之處。

綜上所述，給大鼠一次性注射大劑量STZ(60 mg/kg)后，成模大鼠的胰島受到嚴重破壞，且破壞后不會自行恢復，血糖一直處于高血糖水平;未成模大鼠的胰島也受到不同程度的破壞，其中部分動物的血糖長期處于正常水平，但糖耐量異常，另一部分動物的胰島破壞相對較嚴重，以后導致高血糖。由此說明，血糖的水平與胰島破壞的程度有關。

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