同種異型抗CD3單抗對細胞因子誘導的殺傷細胞體外擴增的影響

張 克，姜 維，周 建，陶 然，李溢柔，李 進，馬世武*，侯金林

(1南方醫科大學附屬南方醫院，廣州 510515;2深圳源興生物醫藥科技有限公司)

細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK細胞)已經應用于腫瘤的臨床治療［1，2］，其體外大量擴增及維持這些細胞的表型和功能，在過繼免疫治療中至關重要。目前體外活化人T細胞的抗CD3單克隆抗體主要包括鼠源性 IgG1(UCHT1)、IgG2a(OKT3)抗體。既往研究發現，同種異型抗CD3單克隆抗體體外刺激 T細胞的結果是不同的［3］，但在體外誘導CIK細胞方面是否存在差異尚不清楚。2011年1月，本研究觀察了同種異型抗 CD3單克隆抗體(UCHT1、OKT3)體外擴增 CIK細胞，并比較其對CIK細胞擴增效率、細胞表型及功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 淋巴細胞分離液(LymphoprepTM);IFN-γ、IL-1a、IL-2(PeproTech);UCHT1(RδD);OKT3(Cuba CJMAB S.A);PAA淋巴細胞培養液(PAA);CD3-FITC、CD56-PE、CD8-PE-Cy5(BD);25 cm2細胞培養瓶(Corning);CytoTox 96?非放射性細胞毒檢測試劑盒(Promega);細胞培養箱(SANYO，MCO-20AIC);流式細胞儀(BD FACSCantoⅡ);細胞計數儀(CytometerTM，Nexcelom Bioscience);倒置相差顯微鏡(Nikon ELIPSE Ti)。

1.2 方法

1.2.1 CIK細胞的體外培養 采集7例健康青年志愿者外周靜脈血20 ml，肝素抗凝。常規密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，細胞計數，加入含1%自體血漿及1000 U/ml IFN-γ的PAA培養基，接種于5 cm×5 cm細胞培養瓶中，細胞密度為2×106個/ml，培養基體積為 5 ml，37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h，共接種2瓶;第2天，兩培養瓶中分別加入50 ng/ml UCHT1、OKT3，并同時加入100 U/ml IL-1α及1000 U/ml IL-2的PAA培養基，定期加入含1000 U/ml IL-2的PAA培養基，調整細胞密度為2×106個/ml。

1.2.2 細胞擴增倍數觀察 應用數胞計數儀于培養后第3、7、10、12、14、21 天觀察細胞形態并計數，計算細胞擴增倍數(擴增倍數=細胞密度×培養基體積÷接種細胞總量)。

1.2.3 CIK細胞表面標志檢測 選取培養基線和培養第14天的CIK細胞，取1×106個細胞置于流式檢測管中，1500 r/m離心5 min，洗滌細胞2次，加入流式單克隆抗體 CD3-PE、CD56-FITC和 CD8-PE-Cy5各10 μl，并設同型對照，4℃避光孵育30 min;1 ml PBS溶液離心洗滌2次，加入2%多聚甲醛200 μl重懸細胞并固定20 min，流式細胞儀分析。

1.2.4 細胞毒實驗 按照試劑盒說明，均為3個復孔，調整CIK細胞密度為4×106/ml，取200 μl接種于96孔圓底板內，之后倍比稀釋，細胞總量依次為4 ×105、2 ×105、1 ×105、0.5 ×105，調整K562 細胞密度為1×105/ml，取100 μl加入到實驗孔，細胞總量1 ×104，實驗孔效靶比分別為40∶1、20∶1、10∶1、5∶1，并設立效應細胞、靶細胞自釋放孔，培養基、容積對照孔，靶細胞最大釋放孔，每孔總體積為200 μl，250 g離心4 min，37℃、5%CO2細胞培養箱中培養4 h。反應停止前45 min，在靶細胞最大釋放孔加入細胞裂解液 20 μl。250 g 離心 4 min，吸取上清 50 μl置于96孔平底板中，每孔加入顯色液50 μl，室溫避光30 min，加入終止液 50 μl，全自動酶聯檢測儀490 nm測各孔的吸光度A值。結果計算公式:殺傷率(%) =(A實驗孔－ A效應細胞自釋放孔－ A靶細胞自釋放孔)/(A靶細胞最大釋放孔－A靶細胞自釋放孔) ×100%。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，結果以表示，計量資料比較采用配對t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CIK細胞的體外增殖 兩組對不同培養時間CIK細胞增殖倍數的比較見表1。

表1 UCHT1及OKT3對不同培養時間CIK細胞增殖倍數的比較()

表1 UCHT1及OKT3對不同培養時間CIK細胞增殖倍數的比較()

注:與 UCHT1組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 n 第3天 第7天 第10天 第12天 第14天 第21天UCHT1 組 7 0.8 ±0.1 3.0 ±4.1 4.0 ±1.6 8.9 ± 4.7 13.3 ± 5.9 33.7 ± 20.9 OKT3 組 7 0.7 ±0.2 3.0 ±1.2 14.8 ±9.8* 39.9 ±36.1* 69.8 ±43.9＊＊ 470.9 ±451.9*

2.2 CIK細胞的表面標志 培養基線和第14天應用流式細胞染色發現，基線CD3+細胞頻數為(57.30±10.40)%;第 14天時，OKT3組 CD3+細胞升至(95.13 ±4.49)%，UCHT1組升至(75.79 ±29.66)%，兩組比較P＞0.05。基線CD3+CD8+細胞頻數為(28.82±13.36)%;第 14天時，OKT3組C細胞升至(74.94 ±11.45)%，UCHT1 組升至(47.27 ±29.38)%，兩組比較 P ＜0.05?；€細胞頻數為(27.17 ±9.32)%;第 14 天時，OKT3組降至(16.24±13.96)%，而 UCHT1組升至(38.91 ± 25.23)%，兩組比較 P ＜ 0.05。基線細胞頻數為(6.00 ±5.66)%;第 14 天時，OKT3組升至(14.09±14.35)%，UCHT1 組升至(18.29±14.04)%，兩組比較差異無統計學意義。基線細胞頻數為(21.59 ±9.99)%;第 14天時，OKT3組降至(3.03±3.81)%，UCHT1 組為(21.87 ±28.82)%，兩組比較 P ＞0.05。

2.3 CIK細胞對K562細胞的細胞毒作用 選取3例進行細胞毒試驗，比較兩組細胞對K562細胞的毒性作用。當效靶比分別為 40∶1、20∶1、10∶1、5∶1時，OKT3 組、UCHT1 組分別為(9.46 ±8.90)%vs(50.13 ± 14.00)%、(5.01 ± 5.02)%vs(44.65 ±11.63)%、(2.85 ±2.85)%vs(27.28 ±12.05)%、(1.18 ±1.18)%vs(11.84 ±10.48)%。當效靶比為20∶1時，兩組比較 P=0.078，結果提示:對 K562的細胞毒作用，UCHT1組有高于OKT3組的趨勢。其余各效靶比比較，雖然UCHT1組對K562的殺傷率均高于OKT3組，但均無統計學意義。

3 討論

1991年Schmidt-Wolf在CD3激活的殺傷細胞基礎上制備出了一類新型免疫細胞，即CIK細胞，CIK細胞是人外周血單核細胞在體外經多種細胞因子刺激后獲得的異質細胞群，由于該細胞同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子，故又稱為NK細胞樣T淋巴細胞，兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和自然殺傷細胞非主要組織相容性復合體限制等特點。體外誘導、培養CIK細胞需要多種細胞因子，包括抗 CD3單抗、IFN-γ、IL-1a、IL-2等。目前應用較多的抗 CD3單抗為 UCHT1、OKT3。UCHT1及OKT3均為鼠源性抗CD3單克隆抗體，其中UCHT1是IgG1型抗體，而OKT3是IgG2a型抗體。OKT3、UCHT1是同種異型的單克隆抗體，通過與CD3分子緊密結合，識別CD3分子的ε亞基，從而活化T細胞［4，5］。盡管不同亞型的抗CD3單克隆抗體均作用于相同的CD3分子ε亞單位，但是由于Fc受體的不同，使得不同亞型的抗CD3單克隆抗體對T細胞的活化作用也不盡相同［6，7］。本研究比較同種異型的抗CD3單抗對CIK細胞的擴增倍數、表型及對K562細胞殺傷作用，尋找何種亞型的抗CD3單抗更適合體外誘導、培養CIK細胞。

我們研究發現，OKT3擴增CIK細胞總數明顯高于 UCHT1，其主要成為 CD3+CD8+細胞，而相對細胞的頻數較低。細胞毒試驗顯示，UCHT1組的殺傷效果較OKT3組有增強的趨勢，這提示了CIK細胞中高比例的細胞可能較 CD3+CD8+對于殺傷腫瘤細胞更加重要。為此，獲得高比例的細胞可能對CIK細胞培養是重要的。

過繼免疫治療一方面需要保證擴增細胞的數量，但更重要的是保證細胞的質量。本研究評價了兩種不同亞型的抗CD3單克隆抗體對CIK細胞擴增的影響，不同亞型的抗CD3單克隆抗體對CIK細胞擴增效率、表型及細胞毒功能方面都是不同的。在應用CIK細胞作為過繼免疫治療時，在保證細胞擴增倍數的情況下，選擇UCTH1能體外誘導出殺瘤活性更強的CIK細胞，因此更適合于體外培養CIK細胞。OKT3擴增CIK細胞數量多但功能弱的原因尚不清楚，今后應進一步探討發生此現象的機制。

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