水蛭提取物對肝癌HepG2細胞DNA去甲基化作用研究

田雪飛 ，孫 婧 ，方 圓 ，伍參榮 ，周 青 ，廖興華

（1.湖南中醫藥大學中西醫結合學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學基礎醫學院，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

DNA甲基化是復制后的修飾，在細胞增殖、分化過程中起重要作用。肝癌相關抑癌基因，例如P16基因等啟動子區域的CpG島甲基化，在肝癌的發生發展過程中起著重要的作用[1]。已有部分研究證實中藥成分槲皮素[2]、CDP成分[3]及復方左金丸[4]等具有降低抑癌基因甲基化水平的作用，提示探索中藥DNA去甲基化作用對中醫藥抗腫瘤研究具有重要的意義。前期研究中我們發現水蛭提取物具有體外抑制肝癌HepG2細胞增殖及誘導凋亡的作用[5]，為此本實驗通過觀察水蛭提取物對肝癌細胞甲基轉移酶（DNMTs）表達的影響，研究中藥有效成分的DNA去甲基化作用，進一步探討水蛭提取物的抗肝癌作用機制。現將實驗方法及結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 水蛭購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院，并由湖南省中醫藥研究院超微工程中心制備成水蛭超微粉。提取物參照研究組前期建立的液氮快速凍融法制備[5]：取水蛭超微粉1.5 g置15 mL離心管內，加10 mL滅菌雙蒸水制成混懸液，再將離心管置液氮內5 min取出，立即放入37℃水浴中迅速融解，重復3次，3 000 r/min離心10 min，取上清液0.22μm微孔濾膜濾過，冷凍干燥18 h即得水蛭提取物凍干粉，-20℃保存備用。

1.1.2 試劑 Trizol RNA提取試劑為美國Gibco公司產品，RT-PCR相關試劑及引物為大連寶生物工程有限公司產品或合成；胎牛血清、低糖DMEM培養基干粉為Gibco公司產品；5-脫氧雜氮胞苷 （5-Aza-cdR）為Sigma公司產品。兔抗人DNMT1、DNMT3a、DNMT3b多克隆抗體購自美國Abcam公司；二抗為生物素標記的羊抗兔IgG，DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.3 細胞株 人肝癌細胞株HepG2購自中南大學湘雅細胞中心并保存。

1.1.4 儀器 倒置熒光顯微鏡 （日本OLYMPUS公司）；自動酶標儀（奧地利TECAN公司）；CO2培養箱（美國Hitachi公司），基因擴增儀（中國杭州大和熱磁力電子公司）；凝膠電泳儀（中國杭州博日科技公司）；凝膠圖像分析系統（中國上海天能科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HepG2培養于含10%小牛血清，100 U/mL鏈霉素和青霉素的DMEM培養液中，37℃，飽和濕度和5%CO2條件下培養，2～4 d更換培養基1次，常規傳代培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 藥物干預濃度及分組 HepG2細胞接種24 h后分別用水蛭提取物、5-Aza-cdR處理。水蛭提取物臨用前用含10%小牛血清的DMEM細胞培養液溶解稀釋成工作濃度。根據預實驗結果確定工作濃度為 3.0、6.0、9.0、12.0、15.0 mg/mL；5-Aza-cdR臨用前用含10%胎牛血清的DMEM細胞培養液稀釋成工作濃度，根據文獻[6]及預實驗結果確定工作濃度為 0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 μM；DNMTs 表達檢測以MTT檢測1/2 IC50含藥量作為工作濃度；均采用未加藥物處理的細胞作為對照組。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖抑制率 取對數生長期HepG2細胞接種96孔板，每孔接種2×104個細胞，分別培養48 h后每孔加入5 g/L MTT 10μL，37℃條件下繼續培養4 h，棄上清液，每孔加入100μL DMSO，酶標儀波長490 nm處檢測吸光度A值，實驗重復3次。按下列公式計算細胞抑制率：細胞生長抑制率（%）=（對照孔A值-試驗孔A值）/對照孔A值×100%。根據不同藥物濃度條件下細胞生長抑制率數值進行相關回歸分析，并根據回歸方程計算半數抑制濃度（IC50）。

1.2.4 RT-PCR 法 檢 測 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達 取對數生長期1×106個HepG2細胞接種于培養瓶，培養6 h待貼壁后，換含水蛭提取物、5-Aza-cdR（IC50含藥量）的培養基處理，對照組以不含藥物的培養基處理。繼續培養48 h后收集細胞，總RNA提取按Trizol試劑盒說明進行，紫外分光光度計測定總RNA濃度與純度，-70℃保存備用。逆轉錄取2μL總RNA，10mM Oligo dT 1μL，用DEPC水補至總體積12μL，70℃ 5 min，冰上驟冷后加入5×buffer 4μL，20 mU/L RNA酶抑制劑 1 μL，10 mM dNTP 2 μL， 200 mU/L MMLV 1 μL，37 ℃ 反應 60 min，94 ℃滅活 5 min。PCR序列根據 Genebank中人 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、GAPDH cDNA序列進行設計。PCR反應體系為總體積 25μL，其中 10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 0.2mM， 上下游引物各 0.5 mM，MgCL21 mM，Taq酶 0.25 μL，cDNA 模板 2 μL，余下用無菌ddH2O補足，引物序列及PCR反應條件見表1。取PCR產物5μL在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳 (含0.5 mg/L溴化乙錠)，PCR條帶應用Eagle EyeⅡ圖像分析處理系統分析結果，基因的相對表達水平等于該基因RT-PCR產物電泳條帶的灰度值/GAPDH RT-PCR產物電泳條帶的灰度值。

表1 PCR引物序列、反應條件及擴增的目的片段大小

1.2.5 免疫組化法檢測DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達 對培養貼壁細胞洗脫涂片于已消毒的載玻片上，37℃過夜；PBS液輕洗，用冷丙酮固定5 min，自然干燥，SABC法免疫組織化學染色(操作流程按說明書進行)。顯微鏡下觀察DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白染色和在細胞中的分布情況。并對每組標本計數300個細胞，計算染色陽性比率。

1.3 統計學分析

所有數據均采用SPSS 11.0統計軟件進行統計學分析，數值變量資料以“x±s”表示，采用單因素方差分析，組間均數比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。IC50采用直線相關回歸分析，根據回歸方程計算求出。

2 結果

2.1 水蛭提取物、5-Aza-cdR對肝癌HepG2細胞增殖抑制作用的影響

MTT實驗結果顯示，水蛭提取物、5-Aza-cdR以劑量依賴性方式抑制HepG2細胞增殖,增殖抑制率隨水蛭提取物、5-Aza-cdR的濃度增高而增加。水蛭提取物、5-Aza-cdR各劑量組吸光度OD值與對照組比較差異均有顯著統計學意義（P＜0.01）。求出直線回歸方程水蛭提取物為y(增殖抑制率)=7.587x（藥物濃度）+7.488，計算可得作用HepG2細胞48 h時的水蛭提取物半數有效抑制濃度IC50=6.0 mg/mL，因此確定3 mg/mL為水蛭提取物進行下一步試驗的工作濃度；直線回歸方程5-Aza-cdR為 y(增殖抑制率)=55.357x（藥物濃度）-3.029，計算可得作用HepG2細胞48 h時的5-Aza-cdR半數有效抑制濃度IC50=0.96μM，因此確定0.48μM為5-Aza-cdR進行下一步試驗的工作濃度。見表2。

表2 水蛭提取物、5-Aza-cdR處理48 h后對肝癌HepG2細胞增殖抑制作用

2.2 水蛭提取物對肝癌HepG2細胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達的影響

水蛭提取物對肝癌HepG2細胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達有抑制作用，IC50藥物濃度下處理 48 h 后，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達降低，與對照組比較兩者間比較差異有統計學意義（P＜0.01）；與陽性對照 5-Aza-cdR 組比較，對 DNMT1 mRNA 表達降低要弱于對照組（P＜0.05），但水蛭提取物抑制DNMT3a、DNMT3b mRNA表達的作用要強于5-Aza-cdR，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表 3，圖 1～3。

圖1 RT-PCR擴增肝癌細胞HepG2 DNMT1 mRNA表達電泳圖

圖2 RT-PCR擴增肝癌細胞HepG2 DNMT3a mRNA表達電泳圖

圖3 RT-PCR擴增肝癌細胞HepG2 DNMT3b mRNA表達電泳圖

2.3 水蛭提取物對肝癌HepG2細胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達的影響

對照組 HepG2 細胞 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b表達依次為DNMT1高度表達，而DNMT3a、DNMT3b分別中、低度表達。經水蛭提取物處理后，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 表 達 明 顯 降低 ， 尤 其DNMT3b表達降低最為明顯，與對照組比較差異有顯著統計學意義 (P＜0.01)，與陽性對照5-Aza-cdR組比較，DNMT1表達要高，但降低DNMT3a、DNMT3b效果明顯優于5-Aza-cdR組，差異有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。 數據見表 4。

表3 水蛭提取物對肝癌HepG2細胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達水平的影響（灰度值，目的基因/GAPDH）

表4 水蛭提取物對肝癌HepG2細胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達水平的影響 （光密度值，）

表4 水蛭提取物對肝癌HepG2細胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達水平的影響 （光密度值，）

組 別水蛭提取物組5-Aza-cdR組對照組DNMT1 562±183**△△323±241**1127±355 DNMT3a 496±164**△624±201*873±352 DNMT3b 182±84**△△341±127*483±212

3 討論

雖然肝癌細胞發生甲基化異常的模式目前仍不清楚， 但 DNMTs， 包括 DNMT1，DNMT3a，DNMT3b已被證實在肝癌細胞內存在表達異常[6-7]。其中DNMT1在正常細胞S期復制過程中具有維持甲基化的功能，多數表現為散在的C被甲基化，而CpG島未被甲基化[8]。DNMT1高表達是CpG島甲基化紊亂的重要因素之一，DNMT1高表達總是伴有總基因組DNA低甲基化和癌基因低甲基化或抑癌基因高甲基化。通過siRNA靶向抑制DNMT1表達后腫瘤相關基因啟動子如RASSF1A、p16等可發生去甲基化而重新表達[9-10]。

有報道及我們本課題組前期研究結果表明水蛭可通過直接殺傷、誘導分化及凋亡等機制發揮抗腫瘤作用[5,11]，能否通過DNA去甲基化作用發揮抗腫瘤作用是值得研究的問題。本研究發現，水蛭提取物對肝癌HepG2細胞具有增殖抑制作用，且具有劑量依賴性。HepG2細胞中DNMT1基因表達明顯增高，DNMT3a、DNMT3b基因呈中、低度表達。而經IC50濃度的水蛭提取物處理后 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b基因表達顯著降低，尤其可完全抑制DNMT3b基因的表達，其蛋白表達也呈弱陽性。雖然水蛭降低DNMT1表達作用遠低于對照藥物甲基化轉移酶抑制劑5-Aza-cdR，但降低DNMT3a、DNMT3b的作用要優于5-Aza-cdR。結果表明DNA去甲基化作用可能是水蛭提取物抗腫瘤的機制之一，也提示從抗腫瘤中藥中篩選DNA去甲基化中藥有效成分具有可行性。

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