密蒙花總黃酮對去勢雄鼠干眼癥淚腺組織中白細胞介素-1β表達的影響

陳佳文，彭清華*，姚小磊*，王 方，李懷風，吳權龍

（湖南中醫藥大學第一附屬醫院眼科學重點學科，湖南 長沙 410007）

干眼癥是由于淚液的量或質的異常，淚膜不穩定和眼表損害而導致的一組眼不適癥狀，又稱角結膜干燥癥。其多發生于大于60歲的女性，是常見的眼表疾病[1]。目前干眼癥的病因尚未明確，炎癥可能是各種類型干眼癥發病的共同機制，而雄激素水平的異常可能是此炎癥反應發生的重要原因[2]。前期研究[3]表明密蒙花提取物治療可顯著抑制雄激素水平降低后兔干眼癥的發生，其作用機制可能與黃酮類物質發揮擬雄激素效應,從而調節淚腺局部炎癥反應有關。為揭示密蒙花總黃酮治療雄激素水平降低所致干眼癥的治療機制，為臨床推廣應用進一步提供科學依據，本實驗觀察了其對去勢導致干眼癥雄鼠淚腺組織中白細胞介素-1β表達的影響。現將實驗方法及結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康、無眼部疾患、1個月齡Wistar雄性大鼠150只，由中南大學湘雅醫學院實驗動物中心提供，SPF級，遠交系，體質量100 g左右。動物合格證號：SCXK（湘）2009-0004。

1.1.2 藥物 密蒙花（產于湖南邵陽）：密蒙花干藥材由湖南九匯現代中藥有限公司提供，其總黃酮制備由課題組在湖南省植物提取工程提取中心完成（密蒙花藥材中蒙花苷含量為0.85%，提取成品中蒙花苷含量約17%，蒙花苷中總黃酮含量＞80%）；丙酸睪酮注射液 （25 g/L，天津金耀氨基酸有限公司生產，國藥準字H12020531）。

1.1.3 試劑 鼠抗人IL-1β單克隆抗體：重慶生物技術有限公司生產；SABC試劑盒：重慶生物技術有限公司生產；DAB顯色劑：重慶生物技術有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 實驗動物隨機分為正常組、假手術對照組、模型組、丙酸睪酮組、密蒙花總黃酮組，每組30只；每組造模后1，3，5月各10只。動物模型制作[4]，將實驗鼠切除雙側睪丸及附睪；假手術組只切開陰囊而不切除睪丸，正常組不做任何處理。造模后1周，待傷口基本愈合開始用藥。正常組、假手術對照組、模型組以生理鹽水灌胃，1次/d；丙酸睪酮組用丙酸睪酮注射液1 mg/kg大腿肌內注射，1次/3 d；密蒙花總黃酮組以密蒙花總黃酮20 mg/kg與生理鹽水混懸液灌胃，1次/d。造模后1，3，5個月后各組10只大鼠，20%烏拉坦腹腔注射全身麻醉下斷頭法處死動物，即刻摘除雙眼眶外淚腺，低溫保存，用4%多聚甲醛固定，供免疫組織化學方法檢測使用。

1.2.2 免疫組織化學法檢測IL-1β的表達 標本常規脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟，采用免疫組織化學SABC法，按試劑盒說明書進行操作。各組標本切片后均按試劑盒說明書進行染色，陽性對照采用乳腺癌石蠟切片，陰性對照采用PBS液代替一抗。結果判定：陰性對照染色結果未見IL-1β特異性免疫反應產物。陽性結果為組織細胞質內出現明確棕黃或棕褐色顆粒。Image-proplus4.5圖像分析系統測定每張切片陽性表達的累計光密度值。在40×10的高倍視野下，每張切片選擇具有代表性的5個陽性視野，選取空白區定標，測定每個視野的光密度，求其平均值。平均光密度值越小，表示陽性反應產物表達越強烈。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠淚腺IL-1β表達的病理形態學改變

正常淚腺上皮細胞為高柱狀，核居基底部，淚腺上皮細胞近腔間有大量分泌泡狀黏液細胞。腺體中淚滴多而細胞漿內無明顯棕黃色顆粒沉著，即無IL-1β陽性表達。本研究中病理形態學改變以去勢造模后5個月才明顯。去勢造模后5個月正常組和假手術對照組淚腺組織中可見少許棕黃色顆粒沉著，即IL-1β幾乎無陽性表達；模型組組織切片中有大量棕黃色顆粒沉著，即IL-1β大量陽性表達；丙酸睪酮組和密蒙花總黃酮組組織切片中可見IL-1β有表達，即有較多棕黃色顆粒沉著（見圖1）。

圖1 密蒙花總黃酮對去勢雄鼠干眼癥淚腺組織IL-1β病理形態學影響光鏡圖（免疫組化染色×200）

2.2 各組大鼠淚腺組織中IL-1β表達比較

淚腺組織中IL-1β的表達比較：造模后1，3，5月，正常組、假手術組IL-1β平均光密度值低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.01）；密蒙花總黃酮組和丙酸睪酮組平均光密度值低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；正常組、假手術對照組的IL-1β表達顯著低于丙酸睪酮組、密蒙花總黃酮組（P＜0.05）；密蒙花總黃酮組平均光密度值高于丙酸睪酮組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠淚腺IL-1β陽性反應細胞的平均光密度值 s，n=10）

表1 各組大鼠淚腺IL-1β陽性反應細胞的平均光密度值 s，n=10）

注：與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與丙酸睪酮組、密蒙花總黃酮組比較*P＜0.05。

時間1月3月5

3 討論

近年來研究表明基于免疫的炎癥反應是各種類型干眼癥發病的共同機制,干眼癥患者淚液和結膜上皮中的多種細胞因子包括 IL-1α、IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β的水平較正常人有顯著改變，且與干眼癥的嚴重程度相關[5]，而性激素水平的異常可能是導致此炎癥反應發生的重要因素[2]。劉超等[6]通過去勢雄兔實驗研究進一步認識到雄激素水平降低可能通過細胞信號轉導途徑，對靶基因轉錄的調控發生改變，導致一系列細胞因子表達的改變，主要通過加重眼表組織炎癥反應及細胞凋亡途徑，損傷淚腺結構、降低淚腺分泌功能；并且通過加重角膜炎癥反應及細胞凋亡，加重癥狀，導致干眼癥。而目前對干眼癥炎癥反應研究較多的是IL-1和TGF，因為IL-1是最重要的促炎因子[7]。Solomon[8]認為IL-1在角結膜干燥癥（KCS）發病中起關鍵作用，因為干眼癥常常伴隨著IL-1濃度增加。IL-1β可以刺激單核細胞和巨噬細胞產生IL-6和TNF；通過單核細胞和巨噬細胞產生IL-8介導對中性粒細胞的趨化作用；刺激中性粒細胞釋放炎癥介質；促進肝細胞合成急性時相蛋白；誘導內皮細胞活化，促進血管內皮細胞表達，黏附分子增加，白細胞與VEC的粘附，誘導內皮細胞分泌IL-2、IL-6和PG等，引起炎癥[4]。通過本實驗研究中模型組IL-1β隨時間延長而增加，且5個月后模型組與正常組比較差異仍有顯著性，也證實了去勢后大鼠缺乏雄激素將導致IL-1β的增加。

密蒙花屬清熱瀉火藥，為馬錢科落葉灌木密蒙花樹的花蕾，性甘，微寒，歸肝經；有清熱（瀉火）養肝，明目退翳之功效；主治目赤翳障，目昏干澀等癥。密蒙花在中醫眼科古籍中作為君藥早有治療干眼癥的論述，如密蒙花散。現代對密蒙花的研究發現：密蒙花含有刺槐素、密蒙花苷、密蒙花萜苷、木犀草素等。其中小鼠口服刺槐素能減輕甲醛性炎癥，還能降低皮膚、小腸血管的通透性及脆性[9]。其抗炎成分為總黃酮和苯乙醇苷[10]。用放射性示蹤標記方法研究還表明密蒙花提取物中含有大量黃酮類物質，黃酮類物質是細胞膜雄激素受體的刺激物，可以與細胞膜雄激素受體結合發揮生物學效應[11]。密蒙花中的黃酮類化合物可與淚腺、角膜等眼表組織中的雄激素受體結合[12]。近期研究表明：密蒙花黃酮類提取物對實驗性雄激素水平下降所致干眼癥有良好的治療效果，其機制主要與密蒙花黃酮能夠有效調節淚腺局部炎癥反應和細胞凋亡，上調TGF-β1mRNA的表達以增加TGF-β1的合成等有關，能改善淚腺組織結構，從而維持淚液基礎分泌量[13-19]。

本實驗研究發現，模型組淚腺組織中IL-1β的表達顯著升高，同時，透射電鏡下可見淚腺組織中出現大量炎性細胞[20]。由此說明，去勢導致的雄激素水平下降而使IL-1β的生成明顯增加，致使淚腺局部產生細胞炎癥反應，最終導致干眼癥。而丙酸睪酮組肌注丙酸睪酮較模型組明顯要低，說明雄激素治療干眼癥主要是通過免疫抑制作用而起到治療作用。本研究表明，密蒙花總黃酮可通過抑制IL-1β的合成而延緩3個月及5個月后雄激素水平下降所致干眼癥的進展，密蒙花總黃酮抑制IL-1β水平可能是干眼癥中其抑制淚腺組織細胞炎癥反應的重要機制之一。

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