消瘀散及水提物與醇提物體外透皮特性的比較研究

肖立新 ，彭力平 *，陳光宇 ，何 群 ，王 適

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.深圳市中醫院，廣東 深圳 518033）

消瘀散由大黃、牡丹皮、白芷、姜黃、蒲黃、薄荷、梔子等10味中藥組成，其功能主治為活血化瘀，消腫止痛，系我院用于治療急性軟組織損傷（血瘀證）的外用中藥協定處方，臨床應用已取得了滿意的療效[1]。但散劑劑型較陳舊而且調制麻煩，臨床使用中起效慢、容易脫落、易過敏、易污染衣物、藥物浪費大等諸多缺點日益突出，因此我們急需對其進行劑型改革。因劑型不同，對藥材前處理的要求不同，總體分水提與醇提兩類，本試驗在提取工藝初篩的基礎上，以藥粉（散劑）作對照，以大黃素[2]為檢測指標，對水提物與醇提物用改良的Franz擴散池及離體兔皮進行體外透皮實驗，比較透皮速度、透皮百分率與皮膚儲量的差別，以探索兩種提取工藝經皮滲透性能的差別，為劑型選擇的可行性、合理性提供依據，為進一步的藥效、毒理及臨床研究奠定基礎。

1 實驗材料

Agilent-1200LC高效液相色譜系統 (美國安捷倫公司，包括G1311A四元梯度泵,G1313A標準型自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1314A紫外檢測器，Agilent Chemstation色譜工作站)；島津UV 2450型紫外可見分光光度計；KUDOS SK3300H型浴式超聲儀 （上海科導超聲儀器有限公司）；MA110型電子分析天平 （上海第二天平儀器廠）；Franz擴散池（S=3.036 cm2V=23.5 mL）；ZTY 智能透皮實驗儀PP2A（鞏義市英峪予華儀器有限公司）；島津電子分析天平（日本）AUY-120。大黃素（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號110756-200110）；消瘀散 （湖南中醫藥大學附屬第一醫院制劑中心提供）；消瘀散水提物與醇提物（自制）；甲醇為色譜醇；其它試劑均為分析醇；雙蒸水（自制）。動物：新西蘭大白兔由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(湘)2009-0012。

2 方法與結果

2.1 消瘀散、水提物、醇提物供試品的制備方法

2.1.1 消瘀散 處方中藥材粉碎，過120目篩，混勻，備用。

2.1.2 消瘀散水提物 處方中藥材適當碎斷，姜黃、薄荷等含揮發油的藥材提取揮發油，用研磨法制成β-環糊精包合物；殘渣與剩余藥材水煎煮2次，合并煎液，減壓濃縮成稠浸膏，真空干燥得干浸膏，按等量遞增法加入揮發油包合物，混勻，備用。

2.1.3 消瘀散醇提物 處方中藥材粉碎，過10目篩，加乙醇回流2次，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮至無醇味，再于水浴上濃縮成稠浸膏，真空干燥得干浸膏，備用。

2.2 大黃素的HPLC定量方法

2.2.1 色譜條件 Phenomenex C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫：0～25 min（75∶25）；25～35 min(75∶25→85∶15)；35～40 min(85∶15→75∶25)；40～50 min(75∶25)；流速1.0 mL/min；檢測波長 254 nm；進樣量 10 μL；柱溫為30℃。

2.2.2 對照品溶液的制備 取大黃素對照品16.5 mg，精密稱定，加甲醇溶解并定容至10 mL，取1.0 mL用甲醇定容至10 mL，再取1.0 mL用甲醇定容至10 mL作為對照品溶液，大黃素質量濃度為16.50 μg/mL。

2.2.3 供試品溶液的制備 分別取消瘀散及水提物與醇提物 (3種供試品生藥濃度一致)約3.0、2.3、1.6 g左右，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25.0 mL，超聲30 min，放冷，再精密稱定質量，用甲醇補足減失的量，搖勻，濾過。精密量取續濾液5.0 mL，揮去溶劑，殘渣加8%鹽酸溶液10 mL，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 mL，超聲30 min，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷(約5 mL)洗滌容器，并入分液漏斗中，振搖萃取，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 陰性對照液的制備 取不含大黃的其余9味藥材按相應的提取方法制備成散劑，再按“2.2.3”法將提取物樣品處理成分析用樣品 （即陰性供試品溶液）。

2.2.5 分離條件的考察 按“2.2.1”色譜條件，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照液各10μL，注入高效液相色譜儀內，調整出峰時間及峰形，使達到符合要求的分離效果，同條件下陰性無干擾。見圖 1～5。

2.2.6 樣品中大黃素含量測定 分別精密吸取對照品與3種供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，用外標一點法計算大黃素含量。

圖1 大黃素對照品HPLC圖

圖2 消瘀散水提物樣品HPLC圖

圖3 消瘀散醇提物樣品HPLC圖

圖4 消瘀散散劑樣品HPLC圖

圖5 大黃陰性樣品HPLC圖

2.2 離體兔皮的制備和處理

取體質健康的新西蘭大白兔1只，耳緣靜脈注射空氣后致死，剝離兔皮，小心除去皮下脂肪和組織，用新鮮配置的生理鹽水反復沖洗，用剪刀除去腹部的兔毛（切勿損傷皮膚），以8%的硫化鈉溶液涂布在離體皮膚上，5 min后用棉簽去除褪下的兔毛，然后用生理鹽水沖洗干凈，最后浸泡于生理鹽水中，-26℃超低溫冰箱中保存備用，1周內用完。每次實驗前1 h取出，同時檢查兔皮的完整性，不能有任何破損。

2.3 實驗裝置及步驟

采用改良的單室Franz擴散池，將生理鹽水加入到接收池中，真皮層一側面向Franz擴散池的接收池，螺絲加固，確保無氣泡產生，使其與離體兔皮緊密接觸，緊貼于離體兔皮上，并觀察接收池中接觸兔皮面有無氣泡，若有氣泡，從取樣口排除氣泡，并補充生理鹽水至刻度。將固定好裝置的Franz擴散池放入ZTY智能透皮實驗儀PP2A中，水浴溫度37℃，電磁恒速攪拌（60 r/min），分別取各實驗樣品2 g，精密稱定，裝入供給池中，使之緊貼表皮層無氣泡，計時，分別在透皮時間為 4、6、8、10、12、24、30、36、48、60、72 h 時，從接收池中取出 12 mL 接收液，同時補充等量的生理鹽水，同樣保持接收液面與皮膚之間無氣泡產生。

2.4 透皮樣品的處理

精密吸取每個時間點取出的透皮接收液，分別置于100 mL的錐形瓶中，蒸干，加8%鹽酸溶液5 mL，超聲處理2 min，微孔濾膜濾過，取續濾液，高效液相進樣10μL測定。分別計算消瘀散及水提物與醇提物中大黃素的累計透過百分率。

2.5 皮膚儲量的測定

將最后一次取樣后的皮膚取下，用剪刀剪去擴散池口上對應的皮膚以外的皮膚部分，將擴散池口大小的皮膚用眼科小剪刀盡快剪碎成皮膚碎塊，用移液管先取總量2/3的生理鹽水于燒杯內，將盛有皮膚碎塊的小燒杯放入冰水中，將剪碎的皮膚倒入玻璃勻漿管中，再將剩余的1/3冷的生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎皮膚塊，一起倒入勻漿管中進行勻漿，左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉動研磨數10次（6～8 min），充分研碎，使皮膚碎塊勻漿化。然后加8%鹽酸溶液10 mL， 超聲處理10 min， 離心 （4 000 r/min，15 min）取上層清液，微孔濾膜濾過，取續濾液10μL，進高效液相色譜儀測定大黃素含量。

2.6 消瘀散及水提物與醇提物累計透皮百分率的測定結果見表1、圖6。

表1 消瘀散及水提物與醇提物的累積透皮百分率 （%）

圖6 消瘀散及水提物與醇提物體外經皮滲透動力學曲線圖

2.7 散劑及水提物與醇提物中大黃素透皮動力學數學模型的擬合

對表1中消瘀散及水提物與醇提物的體外透皮試驗結果采用幾種接近的數學模型進行擬合，建立透皮動力學方程（數學模型），見表2。

由數學模型擬合結果可知，消瘀散及水提物與醇提物中大黃素累積透皮百分率與時間t的函數關系，散劑最接近JohnsonSchumacher模型，水提物最接近一元線性回歸模型，醇提物最接近邏緝斯蒂模型，將找出的最優數學模型（數學方程）列于表3。

表2 消瘀散及水提物與醇提物中大黃素透皮動力學數學模型的擬合

表3 消瘀散及水提物與醇提物中對應的大黃素透皮動力學最優數學方程

2.8 消瘀散及水提物與醇提物中大黃素體外透皮動力學參數的提取及比較

由表4中的計算結果可知，透皮速度快的T8%值小，透皮總量多者Q72h大，消瘀散及水提物與醇提物的透皮速度參數T8%值、透皮總量參數Q72h值可信區間未重疊，差別有統計學意義，故透皮速度由快至慢依次為：醇提物＞水提物＞散劑；透皮總量由多至少依次為：醇提物＞水提物＞散劑；水提物的體外透皮速率是散劑的2.529倍，水提物透皮總量是散劑的2.806倍；醇提物的體外透皮速率是水提物的2.178倍，是散劑的5.509倍，醇提物的體外透皮總量是水提物的1.932倍,是散劑的5.421倍。

表4 各組中大黃素透皮動力學參數的提取及比較（可信區間重疊法）[4]

2.9 消瘀散及水提物與醇提物中大黃素皮膚儲存量的測定結果

由表5可知，各組大黃素皮膚儲量測定結果95%可信區間皆未重疊，差別有統計意義，故皮膚儲量由高到低依次為：醇提物＞水提物＞消瘀散，醇提物是水提物的4.21倍，是散劑的16.63倍，水提物是散劑的3.95倍。

表5 消瘀散及水提物與醇提物中大黃素皮膚儲存量的測定結果 （n=3）

3 討論

本實驗原設計擬采用3個評價指標綜合評分，但因本方系10味中藥的大復方，有效成分含量低、干擾大，最終僅大黃素通過梯度洗脫成功分離，可定量檢測。

藥物透皮屬被動擴散機制，與藥物的脂溶性成正比，醇提物脂溶性成分提取量多，故透皮速度比水提物快、透皮總量多；散劑中藥物必須先從細胞內向細胞外擴散到皮膚表面，然后才能透過皮膚，故透皮速度慢，透皮總量少，藥物大部分未進入皮內發揮作用；水提物因無藥渣，故透皮速度、透皮總量介于兩者之間。

由實驗結果可知，12 h之前，各組透皮速度相差不大，12 h之后，差別顯著，變化最大的是12～48 h這段時間，48 h透皮量趨于飽和，故透皮速度參數定為消瘀散透皮最大量對應的時間即T8%，透皮總量參數定為72 h對應的累積透皮百分率。

外用制劑經皮滲透特性主要參數有透皮速度及某時間的透皮量，這兩個參數不能直接測出，通過實驗測得的不同時間透皮百分率數據，建立兩者的函數關系（數學方程），函數關系（數學方程）有多種（γ＞γ臨），通過比較 R2（包括抽樣誤差）、F、P 值，找出最優數學模型（數學方程），R2、F愈大，P值愈小，說明該函數關系（數學方程或數學模型）愈準確，誤差愈小，進而求出的透皮速度及某時間的透皮量愈正確，誤差范圍愈小。

[1]林松青，彭力平.消瘀散治療急性軟組織損傷的臨床療效研究[J].中醫正骨，2009，4（21）：10-11.

[2]陳德昌,景炳文,楊興易.大黃對燙傷大鼠肝臟內細胞因子基因表達的影響[J].中國危重病急救醫學，1999，10（11）：587-590.

[3]沈陽藥學院.高等數學（下冊）[M].上海：上海科學技術出版社，1979：389.

[4]何 群，鄧桂明，楊廣民，等.咳喘穴位貼片與貼散體外透皮特性比較研究[J].中國中藥雜志，2007，32（18）：1 877-1 880.