甘肅漢、回族2型糖尿病患者PPARγ2基因Pro12Ala多態性分析

關曉麗 劉 怡 劉一帆 陳 慧 (蘭州大學第二醫院，甘肅 蘭州 730030)

遺傳因素在2型糖尿病發病中發揮著重要作用，胰島素抵抗是2型糖尿病發病的顯著病理特征，臨床實踐已證實噻唑烷二酮(TZDs)以過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)為作用靶點，通過改善胰島素敏感性而有效降低具有胰島素抵抗的2型糖尿病患者的血糖水平。目前研究發現PPARγ基因存在多個點突變，主要分布于脂肪組織的PPARγ2，其外顯子B的Pro12Ala變異(rs1801282)為目前研究的熱點，該多態性與代謝綜合征、2型糖尿病、肥胖等代謝病之間具有密切的關系，在不同種族人群中Pro12Ala多態性分布頻率不同。甘肅省屬于多民族雜居的高寒地區，糖尿病發病率逐年增長，而PPARγ基因突變可能影響TZDs的治療效果，本課題以我省回族、漢族2型糖尿病患者為對象，進行Pro12Ala多態性分析，以探討該多態性在2型糖尿病患者的變化及相關性，指導TZDs更佳的使用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 據1999年WHO糖尿病診斷標準確診的2型糖尿病患者，其中漢族2型糖尿病患者119例，男61例，女58例，年齡27～78歲，平均(59.94±11.75)歲，對照組92例，男45例，女47例，年齡28～59歲，平均(58.88±14.46)歲;回族2型糖尿病患者36例，男20例，女16例，年齡19～75歲，平均(53.86±15.31)歲，對照組32例，男18例，女14例，年齡15～74歲，平均(51.15±16.19)歲，所有2型糖尿病患者均為我院內分泌科住院病人，對照組來自于我院體檢中心。入選者三代以上均生活于當地，彼此間無親緣關系，無明顯的慢性肝臟疾病及其他內分泌代謝疾病，無急慢性泌尿系統疾病及其他炎癥疾病，無糖尿病酮癥。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集、臨床及生化檢查 測量研究對象的身高和體重，計算體重指數(BMI)=體重/身高2(kg/m2)，各組均于空腹12小時后，次晨抽取肘正中靜脈血5 ml，取3 ml分離血清用于生化和胰島素測定，2 ml EDTA抗凝用于DNA提取。胰島素抵抗采用穩態模式評估法(HOMA)=(空腹血漿胰島素濃度×空腹血糖濃度)/22.5，血漿胰島素濃度、胰島功能及C肽測定用放射免疫法測定。

1.2.2 基因組DNA的提取 用EZ-10柱式全血基因抽提試劑盒提取外周血DNA。

1.2.3 PPARγ基因型檢測 ①引物序列參照Yen等〔1〕的設計，由華大基因科技合成。上游引物5'-GCC AAT TCA AGC CCA GTC-3';下游引物5'-GAT ATG TTT GCA GAC AGT GTA TCA GTG AAG GAA TCG CTT TCC G-3'，(由于 Pro12Ala 多態性DNA序列本身不存在酶切位點，故在引物的設計過程中人為引入錯配堿基C);②擴增:PCR反應體系:總體積25 μl，模板 DNA 2 μl，上下游引物各 1 μl，dNTP 2 μl，，10 × buffer 3 μl，Taq 酶0.15 μl(大連 Takara公司)，加雙蒸水至 25 μl。96℃預變性3 m，變性96℃ 15 s，退火58℃ 10 s，延伸72℃ 40 s，共30個循環，最后進一步延伸72℃7 m;③酶切:20 μl體系，雙蒸水7 μl，酶切 buffer 2 μl，MspI 酶(Promega 公司)1 μl，PCR 產物10 μl。在冰浴中完成加樣后離心，置37℃恒溫水浴鍋中酶切過夜，取出后在65℃水浴中加熱5 m，立即 －20℃保存;④電泳:取酶切產物5 μl進行濃度為3%的瓊脂糖凝膠電泳，水平電泳槽 70 V，電泳約 40 min，以 DNA片段長度標準物(DL500Marker)為參考，紫外燈下觀察結果并照相。

1.3 統計學分析 根據Hardy-weinberg平衡定律檢測基因型群體代表性。正態分布的計量資料兩兩比較采用t檢驗(Levene方差齊性檢驗)，方差不齊時用Dunnet法比較，基因型頻率用計數法獲得(基因頻率=基因型х2)，組間基因型頻率及等位基因的頻率的比較采用pearson χ2檢驗和校正的χ2檢驗，所有統計分析均采用SPSS13.0統計學軟件進行。

2 結果

2.1 PPARγ2基因Pro12Ala多態性分析 該基因擴增后，PCR產物長度為267 bp，應用MSPI限制性內切酶酶切后，可產生三種基因型:野生型(PP)被酶切后產生兩條片段，分別為225 bp，42 bp;雜合突變型(PA)可產生三條片段，分別為267 bp，225 bp，42 bp;而純和突變型(AA)不能被酶切，產生一條片段，267 bp(見圖1)。所有研究對象均以野生型為主。

圖1 PPARγ2基因Pro12Ala基因型

2.2 甘肅漢、回族2型糖尿病組和對照組PPARγ2、Pro12Ala基因型與等位基因頻率分布 在漢族中，以PP基因型為主，也存在純合突變，差異不具有統計學意義(χ2=0.157，P=0.925)，A等位基因在糖尿病組和對照組分別為4.62%，4.89%，差異不具有統計學意義(χ2=0.017，P=0.897);在回族中，基因型的分布不具有統計學差異(χ2=0.157，P=0.925)，A等位基因在糖尿病組和對照組分別為4.17%，4.69%，差異不具有統計學意義(χ2=0.022，P=0.883)。

2.3 漢、回族2型糖尿病PPARγ2基因中Pro 12Ala多態性與臨床變量的比較 兩組中，攜帶A等位基因的2型糖尿病患者BMI，空腹血糖(FBG)，甘油三酯(TC)均較P等位基因者低，總膽固醇(TC)含量較高，但差異不具有統計學意義(P＞0.05)。

2.4 漢、回族2型糖尿病患者PPARγ2基因中Pro12Ala多態性比較 漢族與回族2型糖尿病患者PPARγ2基因中Pro12Ala多態性位點均以PP基因型為主，A等位基因頻率分別為4.62%，4.17%，差異不具有統計學意義(χ2=0.027，P=0.871)。見表1。

表1 漢、回族2型糖尿病患者PPARγ2基因中Pro12Ala多態性比較〔n(%)〕

3 討論

人PPARγ基因位于染色體3p25。該基因有多種單核苷酸突變，與肥胖、胰島素抵抗及糖尿病等多種疾病相關，研究最為廣泛的是B外顯子的一個錯義突變，脯氨酸(CCA，Pro)變為丙氨酸(GCA，Ala)，因錯義突變正好發生在第12個氨基酸處，故被稱為Pro12Ala。PPARγ2的氨基端含有一個不依賴于配體而依賴于胰島素的活化區域，Pro12Ala即位于該區域內，可引起蛋白構象的改變，使其結合靶基因能力下降，導致轉錄活性下降，蛋白質活性改變，從而影響其功能。

2型糖尿病作為一種慢性的非傳染性多基因遺傳異質性疾病，其病因較復雜，通常認為其發病與遺傳及環境均有密切的關系，英國前瞻性糖尿病研究(UKPDS)〔2〕發現糖尿病發病與種族和民族有著密切的關系，國內大量研究〔3〕也發現，由于生活習俗等差異，少數民族糖尿病及其并發癥的患病率較漢族略高，基因水平的研究也發現有種族和民族差異性。Pro12Ala是PPARγ2基因中較常見的多態性改變，Deeb等〔4〕1998年首次報道了PPARγ2基因Pro12Ala多態性與日本裔美國人2型糖尿病有顯著相關性，且在不同種族人群中的分布頻率不同〔5〕，中國人群Pro12Ala多態性位點以PP基因型為主，A等位基因頻率為2%～4%，日本人4%，而歐美人群占10%左右。本研究回族與漢族間2型糖尿病組突變A等位基因頻率分別為4.17%，4.62%，與國內其他報道〔6，7〕基本一致，與日本人相近，但顯著低于歐美人。結果表明，PPARγ2基因Pro12Ala多態性均以PP基因型為主，回、漢兩民族間及民族內基因型和等位基因頻率間均無顯著性差異，提示該多態性在回、漢兩個民族間不存在民族差異。

Deeb等〔4〕認為A等位基因攜帶者具有高胰島素敏感性和低體重指數，可能更少罹患2型糖尿病，這一結論后又被歐美白種人的大樣本的研究〔8〕所證實，國內部分研究結論亦與此一致〔9〕，認為P等位基因攜帶者更易于發生胰島素抵抗，可能更需要胰島素增敏劑治療。對兩組人群各種臨床及生化指標進行比較發現，攜帶有A等位基因者空腹血糖、體重指數，甘油三酯水平較P等位基因略低，提示可能有一定程度的改善胰島素敏感性、降低體重等作用，但未發現統計學差異，尚不能明確甘肅漢族和回族2型糖尿病患者與PPARγ2基因Pro12Ala多態性之間有明顯關聯性，這與國內部分地區報道〔10，11〕相一致，但亦不能完全否認A等位基因攜帶者使用TZDs會更加有效這一研究結果，因未進一步進行分層分析，尚未明確該多態性與血脂及肥胖之間的相關性。

綜上所述，PPARγ2基因Pro12Ala多態性在甘肅回族和漢族人群中以PP基因型分布為主，兩民族間該多態性分布不存在統計學差異;該多態性與甘肅回族和漢族人群2型糖尿病患病之間尚未得到相關性結論。2型糖尿病是一種多基因病，其發病是由于多個微效基因及環境因素共同作用的結果，該多態性突變率較低，且多態性效應可能被遺傳和環境因素所修飾，如肥胖、血脂紊亂等，也可能與研究對象間生活方式及飲食習慣無明顯差異有關，亦不排除樣本量太小及抽樣誤差等原因造成偏差，需進一步擴大樣本量等。

1 Yen CJ，Beamer BA，Negri C，et al.Molecular scanning of the human peroxisome proliferator activated receptor gamma(hPPAR gamma)gene in diabetic Caucasians:identification of a Pro12Ala PPAR gamma 2 missense mutation〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1997;241(2):270-4.

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6 王國英，李瓊芳，鄧正照，等.PPARγ2基因多態性與2型糖尿病相關性研究〔J〕.中國糖尿病雜志，2002;10(2):73-6.

7 傅 健，池上博司，呂遠棟，等.過氧化物酶體增殖物激活受體γ2基因Pro12→Ala可能是我國漢族人2型糖尿病的保護性等位基因〔J〕.中國糖尿病雜志，2005;13(5):363-5.

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9 荻原俊男，傅 健，池上博司，等.過氧化物酶體增殖物激活受體γ2基因Pro12→Ala可能是我國漢族人2型糖尿病的保護性等位基因〔J〕.中華糖尿病雜志，2005;13(5):363-5.

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