羅格列酮聯合丹參對2型糖尿病db/db小鼠糖脂代謝及轉氨酶的影響

杜玉茗 黃海燕 劉利則 于 燕 姚慶春 (吉林省人民醫院，吉林 長春 3002)

大量研究證明在糖尿病(DM)人群中脂肪肝的發病率可達70%～80%，被認為是代謝綜合征在肝臟的表現。其發病過程與胰島素抵抗(IR)、氧化應激、炎癥等病理變化密切相關〔1～4〕，目前尚無有效治療方法。本研究擬對C57BL/KsJ.db/db(以下簡稱db/db)脂肪肝小鼠給予羅格列酮聯合丹參進行干預治療，探討羅格列酮聯合丹參對DM脂肪肝的預防和治療作用。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及儀器 氯化鈉注射液，由長春豪邦藥業有限公司生產;丹參凍干粉針，由哈藥集團中藥二廠生產;羅格列酮由葛蘭素史克(天津)有限公司生產。TGL-16B型離心機，由上海安亭科學儀器廠生產;AU2700全自動生化分析儀，由日本Olympus公司生產;GC2012型γ放射免疫計數儀由科大創新股份有限公司中佳光電分公司生產。

1.2 動物分組 4周齡DM模型db/db小鼠30只，SPF級，體重(BW)12～16 g(購于上海斯萊克實驗動物有限公司)〔SCXK(滬)2007-0005〕。每籠5只，飼養于標準環境，自由飲食，12 h光照周期。正常喂養1 w，隨機分為3組，模型組、羅格列酮治療(DM-R)組和羅格列酮與丹參聯合用藥(DM-R+D)組各10只。各組小鼠BW與空腹血糖(FBG)無顯著差異(P＞0.05)。

1.3 給藥方式 30只db/db小鼠在飼以高熱量飲食同時，DM-R組每日羅格列酮灌胃，給藥劑量為1.2 mg/kg;DM-R+D組分別通過灌胃和尾靜脈注射給藥物(每日羅格列酮1.2 mg/kg，每日丹參36 mg/kg)。共觀察12 w。

1.4 標本采集 12 w末，測各組小鼠空腹BW后處死小鼠收集血液測FBG、血漿胰島素(INS)水平、血甘油三酯(TG)、肝功谷丙轉氨酶(ALT)、肌酐(Cr)、過氧化物歧化酶(SOD)，腫瘤壞死因子(TNF)-α。肝臟指數(LI)=肝臟濕重(LW)(g)/宰前活重(g)×100%。

1.5 指標測定 血糖測定采用葡萄糖氧化酶法;血清TG、ALT、Cr采用日本Olympus AU2700全自動生化分析儀測定;血漿Ins測定采用美國BACKman化學免疫發光法，放免試劑盒購于北京福瑞生物工程公司。比色法測定SOD，按南京造成生物工程公司提供的試劑盒說明規范操作。TNF-α采用ELISA法測定，按美國ADL公司生產的試劑盒說明規范操作。

1.6 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件，首先用描述性統計和分析研究變量分布，符合正態分布的測定值以±s表示，對偏態分布的變量進行對數轉換，使之正態化再進行統計分析。兩組間的比較采用t檢驗，多組間的比較采用方差分析。

2 結果

2.1 第12周末各組小鼠BW、LW、LI的改變 第12周末DMR組和DM-R+D組小鼠LW、LI與模型組相比均顯著降低(P＜0.01)。見表1。

表1 各組小鼠BW、LW、LI變化的比較(± s，n=10)

表1 各組小鼠BW、LW、LI變化的比較(± s，n=10)

與模型組比較:1)P＜0.01;2)P＜0.05;與DM-R組比較:3)P＜0.05;4)P＜0.01;下表同

組別 BW(g) LW(g) LI(%)模型組49.17±1.2 2.69±2.64 5.25±0.39 DM-R組 45.27±1.78 1.27±2.231) 3.31±0.4641)DM-R+D組 44.01±1.991) 1.01±1.121) 2.692±0.4021)

2.2 第12周末各組小鼠各指標比較 DM-R+D組較DM-R組 INS、FBG、ALT、TG 明顯降低(P ＜0.05)，SOD 明顯升高(P ＜0.05)，TNF-α進一步下降(P＜0.01)。DM-R組INS水平顯著低于模型組(P＜0.01)，TNF-α、FBG、ALT、TG 水平也有明顯降低(P＜0.05)。各組小鼠血常規紅細胞、白細胞、血紅蛋白及血小板皆無明顯異常，各組血Cr皆處于正常范圍內。見表2，表3。

表2 第12周末各組小鼠的血漿INS、TNF-α、SOD的水平(± s，n=10)

表2 第12周末各組小鼠的血漿INS、TNF-α、SOD的水平(± s，n=10)

組別 INS(ng/ml) TNF-α(ng/ml) SOD(U/ml)模型組21.23±3.50 23.2±0.35 24.3±3.16 DM-R組 11.50±2.711) 19.83±0.212) 26.2±2.152)DM-R+D組 9.02±2.143) 9.96±0.284) 28.34±1.513)

表3 各組小鼠FBG、TG和ALT的比較(± s，n=10)

表3 各組小鼠FBG、TG和ALT的比較(± s，n=10)

組別 FBG(mmol/L) TG(mmol/L) ALT(IU/L)模型組29.42±4.39 0.88±0.35 137.1±6.18 DM-R組 11.94±1.541) 0.54±0.191) 79.3±6.811)DM-R+D組 9.78±1.573) 0.49±0.143) 60.9±7.303)

3 討論

自發性2型DM動物模型是指實驗動物未經任何有意識的人工處理、在自然狀態下發生以高血糖、IR為主要特征的DM模型。db/db小鼠是由美國Jackson實驗室于1966年在C57BL/Ks小鼠中發現的攜帶有DM突變基因(db)的動物，是Leptin受體基因缺陷導致的先天性2型DM小鼠。該品系純合子小鼠，早期4周齡即出現顯著DM癥狀，具有高血糖、高血脂、IR等特性，其發病過程與人2型DM非常相似。李娜等觀察到db/db小鼠高脂飲食后出現肝細胞大片壞死、大量炎性細胞浸潤以及纖維組織增生且肝細胞嚴重脂肪變性〔1〕。故本研究采用C57BL/KsJ.db/db小鼠為實驗對象。

IR作為2型DM發病始動因素貫穿病程始終，同時伴發肥胖者，IR尤為突出。近年研究表明，在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)發病機制中IR亦起著重要作用〔2〕，成為T2DM高發NASH獨立危險因素。原因在于胰島素的抑制脂解作用在IR時減弱，游離脂肪酸(FFA)過多產生，經血液循環流入肝臟醋化為TG過多，超過了肝細胞對其氧化利用和合成脂蛋白運出肝臟的能力，使脂質在肝臟沉積引起肝臟脂肪變性。肥胖尤其是由于內臟脂肪沉積引起的中心性肥胖與NASH的發生密切相關。在2型DM所發生的IR基礎上，沉積的內臟脂肪使肝臟的胰島素敏感性進一步下降，2型DM伴發肥胖者IR與NASH之間形成惡性循環。同時，肝細胞內脂肪酸代謝障礙使內質網、線粒體等亞細胞結構發生氧化應激、脂質過氧化，導致肝細胞變性、凋亡以及纖維化〔3，4〕。IR和氧化應激皆可直接使脂肪細胞分泌TNF-α等炎性因子對NASH的發生起作用〔5〕。IR與氧化應激互為因果〔6〕，組成了目前普遍接受的NASH發生機制的“二次打擊學說”。

IR的典型表現為高胰島素血癥。羅格列酮是胰島素增敏劑，其改善肝臟IR作用普遍認為一是通過激活PPARγ使循環胰島素水平降低，阻斷高胰島素血癥對肝臟脂肪合成的誘導作用;二是直接抑制肝細胞脂酰coA合成酶-4的活性，抑制肝臟合成脂肪;三是羅格列酮可抑制脂源性TNF-α的分泌，逆轉TNF-α誘導的GLUT-4及PPARγ的下調，發揮改善IR的效應。本研究結果提示羅格列酮通過降低血漿INS水平改善肝臟IR和使TNF-α表達下調對DM脂肪肝的糖脂代謝紊亂及肝功能起到治療作用。

丹參中具有較強抗氧化能力的成分主要是丹參素。丹參素是各種丹酚酸的基本化學結構。對CCl4誘導的急性和長期肝損傷大鼠給予丹酚酸類化合物Sal A可顯著升高肝臟SOD活性，具有抗氧自由基和抗脂質過氧化的作用〔7〕。現代藥理學認為丹參可降低肝臟脂類特別是TG含量，并能促進脂肪在肝內氧化，還可擴張血管，改善微循環，增加肝臟血流量以及降低血液黏稠度，能有效消減及逆轉肝細胞脂肪變性，促進病情改善和恢復〔8〕。本研究結果提示抗氧化作用與IR改善亦可相互促進。羅格列酮與丹參二者聯合對降低血糖、TG及改善肝功能均較單一用藥具有顯著的修復DM肝脂肪變性作用，這可能與丹酚酸抗氧化應激、抑制炎癥細胞因子的產生進一步改善IR有關。本研究為治療DM脂肪肝提供了新的臨床思路，改善IR、抗氧化應激將在NASH、肝細胞凋亡和肝纖維化的治療中發揮重要作用。

1 李 娜，張 周，馮 穎.自發性2型糖尿病db/db小鼠生物學特性研究〔J〕.實驗動物與比較醫學，2010;30(1):33-7.

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4 Dichi AM，Li ZP，Lin HZ，et al.Cytokines and the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis〔J〕.Gut，2005;54(2):303-6.

5 Bellentani S，Bedogni G，Miglioli L，et al.The epidemiology of fatty liver〔J〕.Eur J Gastroenterol Hepatol，2004;16:1087-93.

6 賈文波，許繼取，宋方方，等.2型糖尿病胰島素抵抗和氧化應激反應〔J〕.中國公共衛生，2006;23(7):769-71.

7 Kim JH，Lewin TM，Coleman RA，et al.Expression and characterization of recombinant rat acyl-coa synthetases 1，4 and 5.Selective inhibition by triacsin C and thiazolidinediones〔J〕.J Biol Chem，2001;276:24667-73.

8 Hu YY，Liu CH，Wang RP，et al.Protective actions of salvianolic acid A on hepatocyte injured by peroxidation in vitro〔J〕.World Gastroenterol，2000;6(3):402-4.