羅格列酮聯(lián)合丹參對2型糖尿病db/db小鼠糖脂代謝及轉(zhuǎn)氨酶的影響

杜玉茗 黃海燕 劉利則 于 燕 姚慶春 (吉林省人民醫(yī)院，吉林 長春 3002)

大量研究證明在糖尿病(DM)人群中脂肪肝的發(fā)病率可達(dá)70%～80%，被認(rèn)為是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)。其發(fā)病過程與胰島素抵抗(IR)、氧化應(yīng)激、炎癥等病理變化密切相關(guān)〔1～4〕，目前尚無有效治療方法。本研究擬對C57BL/KsJ.db/db(以下簡稱db/db)脂肪肝小鼠給予羅格列酮聯(lián)合丹參進(jìn)行干預(yù)治療，探討羅格列酮聯(lián)合丹參對DM脂肪肝的預(yù)防和治療作用。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及儀器 氯化鈉注射液，由長春豪邦藥業(yè)有限公司生產(chǎn);丹參凍干粉針，由哈藥集團(tuán)中藥二廠生產(chǎn);羅格列酮由葛蘭素史克(天津)有限公司生產(chǎn)。TGL-16B型離心機(jī)，由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn);AU2700全自動生化分析儀，由日本Olympus公司生產(chǎn);GC2012型γ放射免疫計(jì)數(shù)儀由科大創(chuàng)新股份有限公司中佳光電分公司生產(chǎn)。

1.2 動物分組 4周齡DM模型db/db小鼠30只，SPF級，體重(BW)12～16 g(購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司)〔SCXK(滬)2007-0005〕。每籠5只，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，自由飲食，12 h光照周期。正常喂養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為3組，模型組、羅格列酮治療(DM-R)組和羅格列酮與丹參聯(lián)合用藥(DM-R+D)組各10只。各組小鼠BW與空腹血糖(FBG)無顯著差異(P＞0.05)。

1.3 給藥方式 30只db/db小鼠在飼以高熱量飲食同時(shí)，DM-R組每日羅格列酮灌胃，給藥劑量為1.2 mg/kg;DM-R+D組分別通過灌胃和尾靜脈注射給藥物(每日羅格列酮1.2 mg/kg，每日丹參36 mg/kg)。共觀察12 w。

1.4 標(biāo)本采集 12 w末，測各組小鼠空腹BW后處死小鼠收集血液測FBG、血漿胰島素(INS)水平、血甘油三酯(TG)、肝功谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酐(Cr)、過氧化物歧化酶(SOD)，腫瘤壞死因子(TNF)-α。肝臟指數(shù)(LI)=肝臟濕重(LW)(g)/宰前活重(g)×100%。

1.5 指標(biāo)測定 血糖測定采用葡萄糖氧化酶法;血清TG、ALT、Cr采用日本Olympus AU2700全自動生化分析儀測定;血漿Ins測定采用美國BACKman化學(xué)免疫發(fā)光法，放免試劑盒購于北京福瑞生物工程公司。比色法測定SOD，按南京造成生物工程公司提供的試劑盒說明規(guī)范操作。TNF-α采用ELISA法測定，按美國ADL公司生產(chǎn)的試劑盒說明規(guī)范操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，首先用描述性統(tǒng)計(jì)和分析研究變量分布，符合正態(tài)分布的測定值以±s表示，對偏態(tài)分布的變量進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，使之正態(tài)化再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 第12周末各組小鼠BW、LW、LI的改變 第12周末DMR組和DM-R+D組小鼠LW、LI與模型組相比均顯著降低(P＜0.01)。見表1。

表1 各組小鼠BW、LW、LI變化的比較(± s，n=10)

表1 各組小鼠BW、LW、LI變化的比較(± s，n=10)

與模型組比較:1)P＜0.01;2)P＜0.05;與DM-R組比較:3)P＜0.05;4)P＜0.01;下表同

組別 BW(g) LW(g) LI(%)模型組49.17±1.2 2.69±2.64 5.25±0.39 DM-R組 45.27±1.78 1.27±2.231) 3.31±0.4641)DM-R+D組 44.01±1.991) 1.01±1.121) 2.692±0.4021)

2.2 第12周末各組小鼠各指標(biāo)比較 DM-R+D組較DM-R組 INS、FBG、ALT、TG 明顯降低(P ＜0.05)，SOD 明顯升高(P ＜0.05)，TNF-α進(jìn)一步下降(P＜0.01)。DM-R組INS水平顯著低于模型組(P＜0.01)，TNF-α、FBG、ALT、TG 水平也有明顯降低(P＜0.05)。各組小鼠血常規(guī)紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白及血小板皆無明顯異常，各組血Cr皆處于正常范圍內(nèi)。見表2，表3。

表2 第12周末各組小鼠的血漿INS、TNF-α、SOD的水平(± s，n=10)

表2 第12周末各組小鼠的血漿INS、TNF-α、SOD的水平(± s，n=10)

組別 INS(ng/ml) TNF-α(ng/ml) SOD(U/ml)模型組21.23±3.50 23.2±0.35 24.3±3.16 DM-R組 11.50±2.711) 19.83±0.212) 26.2±2.152)DM-R+D組 9.02±2.143) 9.96±0.284) 28.34±1.513)

表3 各組小鼠FBG、TG和ALT的比較(± s，n=10)

表3 各組小鼠FBG、TG和ALT的比較(± s，n=10)

組別 FBG(mmol/L) TG(mmol/L) ALT(IU/L)模型組29.42±4.39 0.88±0.35 137.1±6.18 DM-R組 11.94±1.541) 0.54±0.191) 79.3±6.811)DM-R+D組 9.78±1.573) 0.49±0.143) 60.9±7.303)

3 討論

自發(fā)性2型DM動物模型是指實(shí)驗(yàn)動物未經(jīng)任何有意識的人工處理、在自然狀態(tài)下發(fā)生以高血糖、IR為主要特征的DM模型。db/db小鼠是由美國Jackson實(shí)驗(yàn)室于1966年在C57BL/Ks小鼠中發(fā)現(xiàn)的攜帶有DM突變基因(db)的動物，是Leptin受體基因缺陷導(dǎo)致的先天性2型DM小鼠。該品系純合子小鼠，早期4周齡即出現(xiàn)顯著DM癥狀，具有高血糖、高血脂、IR等特性，其發(fā)病過程與人2型DM非常相似。李娜等觀察到db/db小鼠高脂飲食后出現(xiàn)肝細(xì)胞大片壞死、大量炎性細(xì)胞浸潤以及纖維組織增生且肝細(xì)胞嚴(yán)重脂肪變性〔1〕。故本研究采用C57BL/KsJ.db/db小鼠為實(shí)驗(yàn)對象。

IR作為2型DM發(fā)病始動因素貫穿病程始終，同時(shí)伴發(fā)肥胖者，IR尤為突出。近年研究表明，在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)發(fā)病機(jī)制中IR亦起著重要作用〔2〕，成為T2DM高發(fā)NASH獨(dú)立危險(xiǎn)因素。原因在于胰島素的抑制脂解作用在IR時(shí)減弱，游離脂肪酸(FFA)過多產(chǎn)生，經(jīng)血液循環(huán)流入肝臟醋化為TG過多，超過了肝細(xì)胞對其氧化利用和合成脂蛋白運(yùn)出肝臟的能力，使脂質(zhì)在肝臟沉積引起肝臟脂肪變性。肥胖尤其是由于內(nèi)臟脂肪沉積引起的中心性肥胖與NASH的發(fā)生密切相關(guān)。在2型DM所發(fā)生的IR基礎(chǔ)上，沉積的內(nèi)臟脂肪使肝臟的胰島素敏感性進(jìn)一步下降，2型DM伴發(fā)肥胖者IR與NASH之間形成惡性循環(huán)。同時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪酸代謝障礙使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、凋亡以及纖維化〔3，4〕。IR和氧化應(yīng)激皆可直接使脂肪細(xì)胞分泌TNF-α等炎性因子對NASH的發(fā)生起作用〔5〕。IR與氧化應(yīng)激互為因果〔6〕，組成了目前普遍接受的NASH發(fā)生機(jī)制的“二次打擊學(xué)說”。

IR的典型表現(xiàn)為高胰島素血癥。羅格列酮是胰島素增敏劑，其改善肝臟IR作用普遍認(rèn)為一是通過激活PPARγ使循環(huán)胰島素水平降低，阻斷高胰島素血癥對肝臟脂肪合成的誘導(dǎo)作用;二是直接抑制肝細(xì)胞脂酰coA合成酶-4的活性，抑制肝臟合成脂肪;三是羅格列酮可抑制脂源性TNF-α的分泌，逆轉(zhuǎn)TNF-α誘導(dǎo)的GLUT-4及PPARγ的下調(diào)，發(fā)揮改善IR的效應(yīng)。本研究結(jié)果提示羅格列酮通過降低血漿INS水平改善肝臟IR和使TNF-α表達(dá)下調(diào)對DM脂肪肝的糖脂代謝紊亂及肝功能起到治療作用。

丹參中具有較強(qiáng)抗氧化能力的成分主要是丹參素。丹參素是各種丹酚酸的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。對CCl4誘導(dǎo)的急性和長期肝損傷大鼠給予丹酚酸類化合物Sal A可顯著升高肝臟SOD活性，具有抗氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化的作用〔7〕。現(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為丹參可降低肝臟脂類特別是TG含量，并能促進(jìn)脂肪在肝內(nèi)氧化，還可擴(kuò)張血管，改善微循環(huán)，增加肝臟血流量以及降低血液黏稠度，能有效消減及逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞脂肪變性，促進(jìn)病情改善和恢復(fù)〔8〕。本研究結(jié)果提示抗氧化作用與IR改善亦可相互促進(jìn)。羅格列酮與丹參二者聯(lián)合對降低血糖、TG及改善肝功能均較單一用藥具有顯著的修復(fù)DM肝脂肪變性作用，這可能與丹酚酸抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生進(jìn)一步改善IR有關(guān)。本研究為治療DM脂肪肝提供了新的臨床思路，改善IR、抗氧化應(yīng)激將在NASH、肝細(xì)胞凋亡和肝纖維化的治療中發(fā)揮重要作用。

1 李 娜，張 周，馮 穎.自發(fā)性2型糖尿病db/db小鼠生物學(xué)特性研究〔J〕.實(shí)驗(yàn)動物與比較醫(yī)學(xué)，2010;30(1):33-7.

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6 賈文波，許繼取，宋方方，等.2型糖尿病胰島素抵抗和氧化應(yīng)激反應(yīng)〔J〕.中國公共衛(wèi)生，2006;23(7):769-71.

7 Kim JH，Lewin TM，Coleman RA，et al.Expression and characterization of recombinant rat acyl-coa synthetases 1，4 and 5.Selective inhibition by triacsin C and thiazolidinediones〔J〕.J Biol Chem，2001;276:24667-73.

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