辛伐他汀對大鼠腦缺血再灌注損傷后線粒體游離鈣，細胞色素C表達水平的影響

王柏欣 陳 梅 王淑秋 王 昕 陳廷玉 王景濤 徐 輝 邱洪斌

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

他汀類藥物可競爭性抑制膽固醇合成酶系中的關鍵酶羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶，使膽固醇合成受到限制。最近，實驗發現辛伐他汀能減輕腦缺血再灌注損傷〔1〕，其機制尚未完全闡明。本文在制造大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的基礎上，探討辛伐他汀抗腦缺血再灌注損傷作用是否與抑制腦缺血再灌注損傷后細胞色素C以及線粒體游離鈣的釋放有關，為擴大辛伐他汀的臨床用途提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及分組 健康成年Wistar大鼠，250～300 g，隨機分為正常組、假手術組、模型組、辛伐他汀組。模型組和辛伐他汀組都應用線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，缺血時間為 30 min，再灌注時間分別為 1、2、3、5、7 d，每個時間點 6 只大鼠。辛伐他汀組在術后第1天開始，予辛伐他汀20 mg/kg灌胃，假手術組及缺血再灌注組用相同體積的等滲鹽水灌胃，正常組正常喂養。

1.1.2 試劑 辛伐他汀，浙江京新藥業股份有限公司提供;大鼠細胞色素C酶聯免疫檢測試劑盒，上海西塘生物試劑公司提供;鈣測定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 建立腦缺血再灌注模型 根據大腦中動脈栓塞法〔2〕制備腦缺血再灌注模型。予10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，將動物仰臥位固定(上門齒、四肢遠端用粗線固定于鼠板上)，碘伏消毒頸部皮膚，頸部正中切口，分離出頸總動脈、頸外動脈以及頸內動脈，分別接扎頸總動脈及頸外動脈，在頸總動脈距離分叉處將尼龍線導入頸內動脈，插入線栓深度約為(18.0±0.5)mm，感到輕微阻力時立即停止插線。然后縫合傷口，留置線頭于體外，30 min后將線拴提至頸總動脈內，完成再灌注。術后將室溫控制在25℃ ～30℃，根據動物狀況注射速尿或抗生素預防腦水腫和感染。假手術組除進線1.5 mm外，其余處理相同。辛伐他汀組在模型制作成功后，在術后第1天開始給藥。

1.2.2 大鼠神經功能Longa評分〔2〕無神經功能缺失癥狀，活動正常者，計0分;不能完全伸展對側前爪，計1分;動物爬行時出現向右轉圈(追尾現象)，計2分;身體向偏癱側傾倒者，計3分;不能自發行走，意識喪失者，計4分。評分為0分和4分者均被剔除，神經功能評價在取材前進行。

1.2.3 腦組織勻漿的制備 取大鼠，10%水合氯醛麻醉，斷頭取腦，取手術側半腦，在冰生理鹽水中仔細剝離腦膜和血管，剪碎，清洗殘血，沖洗至冰生理鹽水無色澄清，吸水紙吸去多余水分，稱重，剪碎，按稱重量的9倍量取生理鹽水(4℃)，玻璃勻漿器制備成10%腦組織勻漿。

1.2.4 腦組織線粒體游離鈣含量的測定 取制備好的10%的組織勻漿，低溫離心2 000 r/min，10 min，放棄沉淀，取上清液以10 000 r/min低溫離心15 min，沉淀物為線粒體。采用甲基百里香酚藍比色法測定鈣離子的含量，嚴格按照說明書中的步驟操作。

1.2.5 腦組織細胞色素C含量的測定 取10%的腦組織勻漿，低溫3 500 r/min離心，10 min，取上清液。酶聯免疫吸附法(ELISA)測定腦組織勻漿上清液中細胞色素C含量，具體步驟按照試劑盒說明書操作。

2 結果

2.1 辛伐他汀對細胞色素C含量的影響 正常組及假手術組細胞色素C表達很少，而且正常組與假手術組之間無明顯差異。模型組及辛伐他汀組細胞色素C表達明顯增加，與假手術組比較具有統計學差異(P＜0.05)。而且在相同時間段，辛伐他汀組與模型組比較，細胞色素C的含量明顯減少，具有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.2 各組線粒體游離鈣表達比較 正常組及假手術組線粒體游離鈣有基礎表達，模型組與辛伐他汀組在缺血再灌注后1 d時表達量最高，隨著再灌注時間的延長其表達量減少。與假手術組比較，模型組的鈣離子含量增高，而且具有顯著性差異(P＜0.05);在相同時間點，與模型組比較，辛伐他汀組線粒體游離鈣顯著減少，具有顯著性差異(P＜0.05)。見表2。

表1 各組細胞色素C表達比較(±s，n=6，mmol/L)

表1 各組細胞色素C表達比較(±s，n=6，mmol/L)

與假手術組比較:1)P﹤0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;下表同

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表2 各組線粒體游離鈣表達比較(±s，n=6，mmol/gprot)

表2 各組線粒體游離鈣表達比較(±s，n=6，mmol/gprot)

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3 討論

細胞凋亡是在生理和病理條件下的一種主動的死亡方式，受細胞內、外因子調控的生理學過程。在腦缺血再灌注的中心區，由于血液供給急劇減少，細胞能量供給匱乏，ATP耗竭，Na+/K+泵衰竭，導致大多數細胞腫脹、壞死。而在缺血半暗帶區由于有側支循環供血，缺血程度較缺血中心區輕，存在部分能量供應，則細胞損害相對較輕且進展慢。再灌注損傷可產生鈣離子失衡，內質網和線粒體功能異常，過氧化作用增強等，這些均可以導致DNA損傷，后者如不能及時修復，積累到一定程度，則可通過啟動凋亡程序，引起細胞凋亡，并隨再灌注時間的延長，DNA損傷的積累，凋亡細胞亦不斷增加〔3〕。研究表明，神經元凋亡在腦缺血再灌注損傷中發揮重要作用〔4〕，凋亡神經元的多少決定著缺血引起的損害最終范圍大小。腦缺血再灌注和細胞凋亡關系密切，前者通過能量代謝障礙、氧應激和鈣超載等導致細胞凋亡;而后者同壞死一起，參與缺血-再灌注后細胞的喪失。在缺血再灌注的過程中，腦組織產生的氧自由基、細胞內鈣超載和線粒體損傷均可誘發神經細胞的凋亡。

線粒體損傷在腦缺血再灌注神經元損傷中扮演了關鍵的角色〔5〕，主要是通過調控細胞凋亡而促進腦缺血再灌注損傷。線粒體在細胞存亡機制，主要有兩方面作用，①由于線粒體膜間隙的細胞色素C釋放至胞質后觸發caspase級聯，導致細胞死亡;②線粒體外膜上的Bcl-2蛋白家族調控細胞色素C自線粒體釋放，因此，細胞色素C在介導細胞凋亡發生的過程中發揮著重要的作用。細胞內鈣作為第二信使、代謝調節因子和膜穩定劑在細胞正常機能活動中起重要作用。生理情況下，鈣在細胞內外存在很大的濃度差，這依賴于細胞膜正常通透性及胞漿鈣離子外排機制來維持，后一過程需消耗能量。腦缺血缺氧時主要由于ATP供應不足、NMDA受體過度興奮介導與其耦聯的鈣通道開放、膜通透性增大及封阻機制障礙而致細胞外鈣內流增加、胞漿鈣外排障礙，造成細胞內鈣離子濃度增高〔6〕。

鈣超載時，一方面刺激線粒體鈣泵攝鈣，使胞漿內鈣向線粒體轉移，過多的Ca2+與線粒體內含磷酸根的化合物結合成不溶性磷酸鈣，干擾線粒體的氧化磷酸化，使ATP生成減少;另一方面，細胞內游離鈣增加，激活多種鈣依賴性降解酶，導致基質水解，損傷細胞。細胞內鈣超載會引起神經元功能和結構完整性破壞，導致細胞死亡或凋亡。而且現在研究表明，Ca2+可能是造成腦缺血損傷各種因素最后作用的共同通路〔7〕。

因此，鈣離子超載以及細胞色素C的釋放在介導細胞凋亡的過程中具有重要的意義。本實驗結果顯示:辛伐他汀可以明顯地降低腦缺血再灌注損傷后細胞色素C以及線粒體鈣的含量。推測辛伐他汀具有抑制細胞凋亡的作用，而且其機制可能與抑制損傷后過度表達的細胞色素C以及線粒體鈣有關，但具體的機制還有待于進一步研究。

1 Tobert JA.Simvastatin and beyond:the history of the HMG-CoA reducate inhibitors〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2003;2(7):517-26.

2 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20(1):84-91.

3 Anagrama T，LAN J，Henshall DC，et al.Induction of oxidative DNA damage in the peri-infarct region after permanent focal cerebral ischemia〔J〕.J Neurochem，2000;75(4):1716-28.

4 Lipton P.Ischemic cell death in brain neurons〔J〕.Physiol Rev，1999;79(4):1431-568.

5 Cao G.Mitochondrial apoptotic signaling pathway in ischemic neuronal death〔J〕.Cereb blood Flow Metab，2001;21:321-33.

6 Honde HM，Korge P，Weiss JN.Mitochondria and ischemia/reperfusion injury〔J〕.Ann NY Acad Sci，2005;1047:248-58.

7 陳 敏，李長青.鈣與腦缺血再灌注后神經細胞凋亡〔J〕.腦與神經疾病雜志，2003;11(4):253-5.