辛伐他汀對膿毒癥大鼠肝功能的影響

趙鶴齡 陸 鵬 (河北省人民醫院重癥醫學科，河北 石家莊 05007)

重度膿毒癥和膿毒癥休克是危重疾病監護病房(ICU)病人主要死亡原因之一，盡管相關指南及集束化治療的實施，如早期充分抗生素治療、早期目標導向液體復蘇、肺保護性通氣、小劑量糖皮質激素、控制血糖等措施，但膿毒癥死亡人數仍以每年1.5%的比例增加〔1〕。膿毒癥的發病機制主要認為是失控的炎癥級聯反應，最終導致器官衰竭及死亡，相關研究也主要集中在對炎癥反應的調控〔2〕。本研究應用盲腸結扎及穿孔(CLP)方法制作大鼠膿毒癥模型，觀察辛伐他汀預處理對膿毒癥大鼠肝功能的影響，為臨床膿毒癥防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雌性Wistar大鼠80只，體重200～250 g(河北醫科大學實驗動物中心，合格證編號:909043)。飼養于恒溫(20℃)清潔飼養室，喂養普通大顆粒飼料，給予充足水分，通風良好，溫度適宜，所有大鼠實驗前均于飼養室適應性飼養1 w。實驗前禁食12 h，自由飲水。80只大鼠隨機分為4組，正常對照組(8只);假手術組(24只);膿毒癥模型組(24只);辛伐他汀干預后造模組(24只)。除正常組外其他各實驗組按留取標本處死大鼠時間點(造模后6、24 h和48 h)，隨機分為3組，每組8只。

1.2 藥物干預與造模 辛伐他汀干預后組每只大鼠按辛伐他汀20 mg·kg－1·d－1將辛伐他汀片(杭州默沙東制藥有限公司H19990366)碾碎后溶于1 ml生理鹽水灌胃，其余各組給予等量生理鹽水。給藥時間為14 d后，按傳統方法制作大鼠CLP膿毒癥模型，造模后大鼠出現精神倦怠、躁動、寒戰、腹脹、眼角分泌物增多、豎毛等表現，直腸溫度較造模前升高或降低1℃視為造模成功的標志。觀察期間出現死亡的動物將其排除，并重新造模補充。

1.3 標本收集與檢測 正常對照組大鼠給藥14 d后即留取血液標本，余各組在標本留取時間點從大鼠頸動脈取血2～3 ml后處死大鼠，離心機3 000 r/min，10 min取上清液，并放于－70℃冰箱保存待檢。應用大鼠谷氨酸脫氫酶(GLDH)ELISA檢測試劑盒和大鼠谷胱甘肽硫轉移酶(GST)ELISA檢測試劑盒(R＆D美國)檢測大鼠血清GLDH和GST水平。

1.4 統計學處理 應用SPSS10.0統計軟件，計量資料數據以±s表示，組間差異采用單因素方差分析及Q檢驗。

2 結果

2.1 血清GST和GLDH變化 造模組大鼠血清GST和GLDH造模后進行性升高，明顯高于正常對照組和假手術組大鼠同時間點血清GST和GLDH水平(P＜0.05)，造模后按6、24、48 h各時間點進行各組間比較，造模組較未造模組各時間點GST及GLDH均顯著升高(P＜0.05);而辛伐他汀干預組大鼠各時間點血清GST和GLDH水平明顯低于膿毒癥模型組大鼠(P＜0.05)。見表1，表2。

表1 各組血清GLDH比較(± s，pg/ml，n=8)

表1 各組血清GLDH比較(± s，pg/ml，n=8)

與正常對照組比較:1)P＜0.05;與假手術組比較:2)P＜0.05;與膿毒癥模型組比較:3)P＜0.05;下表同

組別6 h 24 h 48 h正常對照組4.78±0.53 － －假手術組 6.74±1.18 6.63±2.37 5.75±2.17膿毒癥模型組 16.29±2.891)2) 28.74±3.971)2) 36.93±2.471)2)辛伐他汀干預組 10.44±1.861)2)3) 19.81±4.821)2)3) 30.63±3.631)2)3)

2.2 大鼠一般表現 假手術組大鼠在手術后2～3 h后可自由飲水及活動，未表現出任何異常狀態。膿毒癥模型組及辛伐他汀干預后造模組在手術后2～3 h后大鼠可自由飲水，6～8 h出現精神倦怠、躁動、寒戰、腹脹、眼角分泌物增多、豎毛等表現，直腸溫度較造模前升高或降低1℃，提示造模成功。

表2 各組血清GST比較(± s，ng/ml，n=8)

表2 各組血清GST比較(± s，ng/ml，n=8)

組別6 h 24 h 48 h正常對照組23.13±0.99 － －假手術組 25.16±2.64 24.33±2.58 26.86±1.40膿毒癥模型組 50.6±3.071)2) 71.53±5.341)2) 102.48±5.281)2)辛伐他汀干預組 38.29±4.651)2)3) 49.41±5.951)2)3) 72.74±7.411)2)3)

3 討論

本項研究證實，CLP膿毒癥大鼠血清GLDH和GST水平明顯升高，辛伐他汀預處理的膿毒癥大鼠血清GLDH和GST水平盡管高于對照組大鼠，但較未處理的膿毒癥大鼠顯著降低，提示辛伐他汀預處理對膿毒癥大鼠肝功能損害具有一定程度的保護作用。

GST是一組具有解毒和結合功能的同工酶，在肝細胞中主要分布于胞漿。其分子質量較轉氨酶小，更易透過肝細胞膜，肝臟損傷時血清峰值出現比轉氨酶早，因此血清GST是反映急性肝細胞損傷極為敏感的指標。又由于因其半衰期短(1～8 h)，較早比轉氨酶降至正常，從而有助于識別肝細胞損傷的終止〔3〕。GLDH主要分布于肝臟，是肝線粒體的特異性酶，肝線粒體外含量幾乎為零，故可作為肝損害的特異性指標。一旦肝細胞發生病變累及線粒體時，GLDH即有顯著性升高〔4，5〕。本研究提示肝細胞損傷隨膿毒癥進展進一步加重。

感染時促炎因子如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-8 等大量釋放促進了膿毒癥的發展〔6，7〕，進而使可誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達的增加，一氧化氮(NO)產生增加，導致內皮細胞功能及血管機能異常〔8〕。同時存在時間依賴性的白細胞增殖、遷移、黏附的增加和P選擇素在血管內皮的表達。膿毒癥期間除了因組織灌注不足，引起細胞缺血、缺氧而損傷線粒體外，細菌產生的內毒素可直接作用于細胞，產生大量氧自由基并抑制能量生成〔9〕。氧自由基可導致線粒體內部的氧化應激反應，使線粒體內膜發生脂質過氧化以及內膜蛋白中巰基發生氧化而喪失功能，導致線粒體膜電位下降〔10〕，進而引起線粒體鈣超載、呼吸功能障礙和DNA損傷，最終使ATP合成受阻，細胞能量供應不足，凋亡調控系統激活而發生細胞凋亡。此外，細胞因子通過增加組織因子(TF)和纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)釋放和活化誘導凝血功能紊亂，導致微循環中微血栓生成，使微循環受阻，影響器官灌注，膿毒癥時多種途徑的共同作用最終導致了肝臟及其他器官功能障礙。

他汀類藥物屬羥甲基戊二酰輔酶(HMG-CoA)抑制劑，臨床中廣泛用于降血脂治療，他汀類藥物除了降脂作用以外還有一系列有益的生物學效應，被稱為“多效性作用”。他汀類藥物抑制多種炎癥急性期反應物的產生，從而抑制NO產生，維護內毒素休克時受損的血管反應性。他汀類藥物可通過下調內皮細胞黏附分子P選擇素、CD11b、CD18的表達和抑制淋巴細胞功能相關抗原介導的白細胞黏附從而減少白細胞對內皮的黏附。并可明顯減低脂多糖誘導的和金黃色葡萄球菌毒素誘導的白細胞的增殖與遷移。同樣可以通過改變組織纖溶酶原激活劑(tPA)和PAI-1的水平與活性而促進纖維蛋白溶解，減低纖維蛋白原的水平。

他汀類藥物的多種抗炎機制發揮對大鼠炎癥及缺血/缺氧狀態肝臟的保護作用。線粒體發生損傷的主要原因為缺氧，而肝線粒體的特異性酶GLDH升高說明膿毒癥導致肝臟微循環灌注不足，引起肝細胞的缺血、缺氧而發生損傷。本研究表明辛伐他汀可能具有改善膿毒癥時肝臟微循環作用。其機制與他汀類藥物抗炎、免疫調節、改善微循環等多種作用有關。是否他汀類藥物也與在缺血/再灌注損傷狀態時一樣能夠減少膿毒癥大鼠肝細胞凋亡，以及在膿毒癥狀態時肝臟保護的確切機制等尚需深入研究。

1 Angus DC，Linde-Zwirble WT，Lidicker J，et al.Epidemiology of severe sepsis in the United States:analysis of incidence，outcome，and associated costs of care〔J〕.Crit Care Med，2001;29(7):1303-10.

2 Leaver SK，Finney SJ，Burke-Gaffney A，et al.Sepsis since the discovery of Toll-like receptors:disease concepts and therapeutic opportunities〔J〕.Crit Care Med，2007;35(5):1404-10.

3 Chouker A，Martignoni A，Schauer RJ，et al.Alpha gluthathione S-transferase as an early marker of hepatic ischemia/reperfusion injury after liver resection〔J〕.World J Surg，2005;29(4):528-34.

4 O'Brien PJ，Slaughter MR，Polley SR，et al.Advantages of glutamate dehydrogenase as a blood biomarker of acute hepatic injury in rats〔J〕.Lab Anim，2002;36(3):313-21.

5 Difraia R，Wilquet V，Ciardiello MA，et al.NADP+dependent glutamate dehydrogenase in the antarctic psychrotolerant bacterium psychrobacter sp，TAD1，charaterization，protein and DNA sequence，and relationship to other glutamate dehydrogenases〔J〕.Eur J Biochem，2000;267(1):121-31.

6 Andrews P，Azoulay E，Antonelli M，et al.Year in review in intensive care medicine，2006 II.Infections and sepsis，haemodynamics，elderly，invasive and noninvasive mechanical ventilation，weaning，ARDS〔J〕.Int Care Med，2007;33(2):214-29.

7 Marshall JC.Such stuff as dreams are made on:mediator-directed therapy in sepsis〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2003;2(5):391-405.

8 Vo PA，Lad B，Tomlinson JA，et al.Autoregulatory role of endotheliumderived nitric oxide(NO)on lipopolysaccharide-induced vascular inducible NO synthase expression and function〔J〕.J Biol Chem，2005;280(8):7236-43.

9 Crouse E，Exline M，Knoell D，et al.Sepsis:Links between pathogen sensing and organ damage〔J〕.Curr Pharm Des，2008;14(19):1840-52.

10 Schenkman KA，Arakaki LS，Ciesielski WA，et al.Optical spectroscopy demonstrates elevated intracelluar oxygenation in an endotoxic model of sepsis in the perfused hear〔tJ〕.Shock，2007;27(6):695-700.