麝香通心滴丸對穩定動脈粥樣硬化斑塊的機制研究

王 怡，牛子長，何 斌，解小剛，劉 劍，王未沫

心血管疾病是一種嚴重危害人類健康的疾病，全球每年近2 000萬人死于急性心血管事件。易損斑塊是急性心血管事件發生的重要物質基礎，而穩定斑塊、預防斑塊破裂已成為防治急性心血管事件的重要目標［1，2］。麝香通心滴丸是依據芳香溫通法由古方“至寶丹”化裁而來，主要由麝香、人參莖葉總皂苷、蟾酥、人工牛黃、丹參、熊膽、冰片等藥物組成，具有芳香開竅、益氣溫陽、理氣止痛之功效，以上諸藥寒溫并用，以溫為主；通補兼施，以補為輔，既具芳香溫通之性，藥力又平穩和緩。本研究在藥效學實驗的基礎上從脂質代謝、氧化應激、炎癥反應、基質代謝和凋亡等角度，探討麝香通心滴丸穩定家兔易損斑塊的作用機制，為臨床用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物及飼料 日本大耳白家兔91只，雄性，體重1.8kg～2.2kg，購自北大醫學部動物實驗中心。合格證號：SCXK（京）2005－0002。飼養于天津中醫藥大學實驗動物中心，符合《中華人民共和國衛生部實驗動物環境設施標準》二級標準。適應性飼養1周以上備用。高脂飼料配方，普通飼料89%（天津市武清區科達養殖中心）、1%膽固醇、大豆色拉油10%。

1.2 藥物 麝香通心滴丸干粉，黃褐色粉末狀，內蒙古伊泰藥業有限責任公司提供，批號20061120。辛伐他汀，杭州默沙東藥廠生產，批號070112。

1.3 試劑及儀器 總膽固醇（TC）、中國斑點蝰蛇毒；組胺、αactin單克隆抗體；CD68單克隆抗體（美國Thermo）；TC、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）試劑盒（中生北控，批號070371）；基質金屬蛋白酶－（MMP2）、（TIMP2）、單核細胞趨化因子（MCP－1）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、ox－LDL以及血管黏附分子－1（VCAM－1）ELISA 試劑盒，購自美國RB公司；髓質過氧化物酶（MPO），南京建成，批號20080423；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成，批號070603）；TRIZOL總RNA提取試劑盒（美國Invitrogen）；TUNEL細胞凋亡試劑盒（美國Millipore）。

日本Olympus公司正置顯微鏡及成像系統、美國Image－Pro Plus Version 6.0圖像分析系統；半自動生化分析儀（Micro95、荷蘭威圖）。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組及給藥 家兔根據血脂隨機分為正常對照組（11只，每天給予普通飼料200g）及造模組（80只，每天給予高脂飼料50g，再飼以普通飼料150g）。造模組復制高脂飲食伴主動脈球囊拉傷術致動脈粥樣硬化易損斑塊模型，模型復制8周后根據血脂將其隨機分為5組：模型組，麝香通心滴丸2mg／kg、1mg／kg和0.5mg／kg組，陽性對照組（辛伐他汀2mg／kg）。各組分別給予相應藥物，連續灌胃給藥12周。

1.4.2 動物模型建立 家兔高脂飲食（每天給予高脂飼料50 g，再飼以普通飼料150g）8周，并于高脂飼養兩周后行主動脈球囊拉傷術。

1.4.3 藥物觸發 給藥第12周末，參照文獻方法［3，4］對家兔進行藥物觸發，中國斑點蝰蛇毒0.15mg／kg腹膜下注射，30min后耳緣靜脈注射組胺0.02mg／kg，于處死動物前24h、48h給予兩次藥物觸發。

2 結 果

2.1 麝香通心滴丸對動脈粥樣硬化（AS）家兔血清血脂水平的影響 與正常對照組比較，AS家兔血清TC、TG、LDL、TC／HDL均明顯升高，其中以TC升高顯著；麝香通心滴丸各劑量組有不同程度降低血脂水平的作用，其中以降低TC／HDL比值的作用顯著（P＜0.05），辛伐他汀組能夠顯著降低家兔血脂水平（P＜0.05）。詳見表1。

表1 麝香通心滴丸對AS家兔血清血脂水平的影響（±s）

表1 麝香通心滴丸對AS家兔血清血脂水平的影響（±s）

組別 劑量 n TC mmol／L TG mmol／L HDL mmol／L LDL mmol／L TC／HDL正常對照組 － 11 1.44±0.52 0.70±0.18 0.35±0.16 0.29±0.114.00±1.49模型組 － 12 13.58±7.051） 1.33±0.821） 2.05±0.601） 4.37±2.291） 5.94±1.491）麝香通心滴丸組 0.5mg／kg 9 10.59±3.52 0.60±0.15 2.23±0.40 3.30±1.19 4.67±0.812）麝香通心滴丸組 1mg／kg 11 9.21±5.14 0.64±0.22 1.65±0.70 3.56±2.24 5.30±0.89麝香通心滴丸組 2mg／kg 11 9.99±4.85 0.62±0.20 1.88±0.51 3.42±1.46 5.12±1.44辛伐他汀組 2mg／kg 9 7.39±5.872） 0.48±0.132） 1.30±0.542） 2.51±2.282） 4.23±1.972）與正常對照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05

2.2 麝香通心滴丸對AS家兔氧化應激水平的影響 家兔形成AS后SOD活性明顯降低（P＜0.01），而 MPO、MDA、ox－LDL則明顯升高（P＜0.01）；給予麝香通心滴丸干預后，血清SOD明顯升高，其中以高、中劑量組為優（P＜0.05）；降低MPO、MDA、ox－LDL的血清含量（P＜0.05）。詳見表2。

表2 麝香通心滴丸對AS家兔血清SOD活性等指標的影響（±s）

表2 麝香通心滴丸對AS家兔血清SOD活性等指標的影響（±s）

組別 劑量 n SOD（U／mL） MDA（nmol／mL） MPO（U／L） ox－LDL（μg／L）正常對照組 － 11 218.08±35.89 1.76±0.51 66.18±9.1364.48±9.73模型組 － 12 140.31±39.531） 5.53±2.421） 97.27±27.931） 279.85±28.031）麝香通心滴丸組 0.5mg／kg 9 138.25±43.26 4.02±1.302） 70.11±22.572） 193.96±23.512）麝香通心滴丸組 1mg／kg 11 206.47±31.812） 3.05±0.952） 68.67±13.552） 208.36±15.662）麝香通心滴丸組 2mg／kg 11 184.17±33.732） 4.21±1.482） 62.93±28.212） 201.81±14.592）辛伐他汀組 2mg／kg 9 179.47±14.022） 3.00±0.932） 70.43±29.262） 176.80±14.762）與正常對照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05

2.3 麝香通心滴丸對AS家兔血清 MMP2、TIMP2含量和活性的影響 模型組血清 MMP2含量及MMP2／TIMP2較正常組明顯升高（P＜0.01）。麝香通心滴丸2mg／kg組可以明顯降低AS家兔血清MMP2含量；麝香通心滴丸2mg／kg、1mg／kg組可以明顯升高TIMP2含量，降低MMP2／TIMP2（P＜0.05）。詳見表3。

表3 麝香通心滴丸對AS家兔血清MMP2、TIMP2含量和活性的影響（±s）

表3 麝香通心滴丸對AS家兔血清MMP2、TIMP2含量和活性的影響（±s）

組別 劑量 n MMP2（ng／mL） TIMP2（ng／mL） MMP2／TIMP2正常對照組 － 11 927.25±124.26 439.60±48.76 2.04±0.27模型組 － 12 1 160.62±205.971） 449.47±60.74 2.48±0.251）麝香通心滴丸組 0.5mg／kg 8 1 113.21±165.05 482.43±56.65 2.21±0.222）麝香通心滴丸組 1mg／kg 11 1 050.99±125.06 517.84±58.612） 2.00±0.192）麝香通心滴丸組 2mg／kg 11 1 026.49±132.962） 504.87±78.822） 2.05±0.292）辛伐他汀組 2mg／kg 9 982.98±107.612） 484.16±32.04 1.98±0.182）與正常對照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05

2.4 麝香通心滴丸對AS家兔主動脈MMP2和TIMP2mRNA表達的影響（見表4）

表4 麝香通心滴丸對AS家兔主動脈MMP－2、TIMP－2表達的影響（±s） ng／mL

表4 麝香通心滴丸對AS家兔主動脈MMP－2、TIMP－2表達的影響（±s） ng／mL

組別 劑量（mg／kg） n MMP－2 TIMP－2正常對照組 －10 1.07±0.37 1.00±0.28模型組 － 12 2.84±0.661） 1.79±0.841）麝香通心滴丸組 0.5mg／kg 9 2.34±1.21 2.34±0.89麝香通心滴丸組 1mg／kg 12 1.94±1.202） 2.85±0.831）麝香通心滴丸組 2mg／kg 10 2.63±1.07 2.33±0.87辛伐他汀組 2mg／kg 8 1.78±1.112） 2.62±1.032）與正常對照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05

2.5 麝香通心滴丸對AS家兔凋亡細胞密度的影響 （見表5）

表5 麝香通心滴丸對AS家兔凋亡細胞密度的影響（±s）

表5 麝香通心滴丸對AS家兔凋亡細胞密度的影響（±s）

組別 劑量 n 凋亡細胞密度（／mm2）正常對照組 － 10 110.60±29.14模型組 0.5mg／kg 8 97.79±39.67麝香通心滴丸組 1mg／kg 8 58.84±29.821）麝香通心滴丸組 2mg／kg 8 78.69±31.201）麝香通心滴丸組 2mg／kg 8 71.95±32.591）與模型組比較，1）P＜0.05

2.6 麝香通心滴丸對AS家兔血清相關炎性因子含量的影響 （見表6）

表6 麝香通心滴丸對AS家兔血清炎性因子含量的影響（±s）

表6 麝香通心滴丸對AS家兔血清炎性因子含量的影響（±s）

組別 劑量 n MCP－1（pg／mL） VCAM－1（ng／mL） TNF－α（pg／mL）正常對照組 － 10 482.47±25.97 3 089.51±434.45 126.90±11.80模型組 － 12 564.04±67.811） 3 652.71±476.991） 161.22±24.291）麝香通心滴丸組 0.5mg／kg 9 561.75±58.69 3 319.54±498.73 146.27±18.95麝香通心滴丸組 1mg／kg 12 505.91±30.52 3 351.31±376.70 141.16±13.641）2）麝香通心滴丸組 2mg／kg 10 495.82±36.52 3 321.07±308.52 132.48±11.711）2）辛伐他汀組 2mg／kg 8 498.97±13.52 3 406.37±404.73 137.77±11.451）2）與正常對照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01

2.7 麝香通心滴丸對AS家兔主動脈相關炎性因子mRNA表達水平的影響 （見表7）

表7 麝香通心滴丸對AS家兔主動脈相關炎性因子mRNA表達水平的影響（±s）

表7 麝香通心滴丸對AS家兔主動脈相關炎性因子mRNA表達水平的影響（±s）

組別 劑量 n MCP－1mRNA VCAM－1mRNA TNF－αmRNA正常對照組 －10 1.01±0.48 1.11±0.43 1.17±0.58模型組 － 12 4.45±3.831） 3.51±1.511） 18.67±13.391）麝香通心滴丸組 0.5mg／kg 9 3.87±3.28 2.89±1.36 10.82±9.21麝香通心滴丸組 1mg／kg 12 1.95±1.842） 2.20±1.682） 8.75±8.732）麝香通心滴丸組 2mg／kg 10 3.80±2.37 2.97±1.38 13.26±7.84辛伐他汀組 2mg／kg 8 1.82±1.142） 2.38±1.46 9.19±7.962）與正常對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

3 討 論

血脂異常是當今公認的致AS發生的重要原因之一。隨著AS的不斷發展，斑塊中的脂質沉積也不斷增多，并逐漸形成脂核。斑塊中過大的脂核會增加管壁在斑塊肩部的應力，從而升高斑塊的易損性，而肩部也是斑塊破裂最常發生的部位，可見血脂異常和斑塊易損密切相關［5］。本實驗觀察了麝香通心滴丸對AS家兔血脂的影響，結果顯示各劑量組雖有降低TC、TG、LDL的趨勢，但與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。麝香通心滴丸對脂質的影響并非是穩定易損斑塊的主要機制。

氧化應激貫穿于AS發生發展的全過程。在AS早期機體抗氧化能力下降，氧自由基生成增加會引起內皮細胞功能障礙，導致單核細胞黏附，脂質沉積于動脈內膜下。而其對于脂蛋白的氧化修飾，特別是ox－LDL的生成則對AS的發生及易損斑塊的形成起到了關鍵的作用。由此可見提高機體抗氧化能力，減輕氧化應激損傷，降低ox－LDL及MPO的含量應是防治易損斑塊的可能途徑。本實驗中麝香通心滴丸可以明顯提高家兔血清SOD的活性，降低血清MDA含量、MPO活性以及ox－LDL含量（P＜0.05）。提高機體抗氧化能力，減輕氧化應激損傷應是其穩定斑塊的作用機制之一。

斑塊的纖維帽是覆蓋于脂核上的纖維肌性組織，主要由少量的平滑肌細胞和細胞外基質（ECM）構成。ECM尤其是膠原纖維合成和降解代謝的失調是造成斑塊易損、誘發斑塊破裂的重要原因。平滑肌細胞是斑塊中ECM合成的主要來源，而其降解則主要是由MMPs來完成的［6］。

斑塊中MMPs表達和活性的升高會造成ECM降解的增強，直接導致斑塊纖維帽變薄，易損性增加。而TIMP則是MMPs在組織中的天然抑制劑，在體內局部組織的TIMP可以按1∶1的分子比例以非共價鍵結合活化的MMPs，抑制其對特異性ECM蛋白的降解，也可與酶原結合阻止其活化。MMPs與TIMP的失衡則可以造成斑塊內基質代謝失調，直接導致纖維帽變薄、破裂［7－11］。所以抑制 MMPs的過度表達和活性增高也成了防治易損斑塊的研究方向之一。本實驗顯示其可以降低AS家兔血清MMP2含量，升高TIMP2含量，并降低兩者比值（P＜0.05）。提示麝香通心滴丸可以通過降低MMP2的含量及活性防止斑塊內基質的過度降解，穩定斑塊。

炎癥反應可以通過釋放多種炎癥介質增加斑塊的易損性，導致斑塊破裂：血管內皮受損后 MCP－1、ICAM－1、VCAM－1的協同作用下進入到血管內皮下，并在巨噬細胞集落刺激因子（GM－CSF）的作用下活化形成巨噬細胞，通過清道夫受體吞噬ox－LDL，形成泡沫細胞，由于脂質的不斷攝入，泡沫細胞最終崩解形成脂核 ，隨著脂核的不斷增大，斑塊的易損性升高。巨噬細胞可以通過分泌IL－1、TNF－α，上調 MMPs的表達，促進斑塊內的基質降解，誘發斑塊破裂。大量的組織因子，誘發血栓形成［12］。減少斑塊內的炎癥細胞，抑制相關炎癥介質的釋放，減輕斑塊內的炎癥反應是防治易損斑塊的主要機制之一。

本實驗結果發現，麝香通心滴丸2mg／kg和1mg／kg可以明顯降低AS家兔血清TNF－α含量（P＜0.01），而對于血清中MCP－1和VCAM－1含量有降低趨勢。麝香通心滴丸可以通過減少斑塊內的巨噬細胞，減少TNF－α的分泌，從而減輕炎癥反應，防止易損斑塊形成。

［1］Muller J，Tofler G，Stone P.Circadian variation and triggers of onset of acute cardiovascular disease［J］.Circulation，1989，79（4）：733－743.

［2］Naghavi M，Libby P，Falk E，etal.From vulnerable plaque to vulnerable patient：A call for new definitions and risk assessment strategies：PartⅠ［J］.Circulation，2003，108（14）：1664－1672.

［3］Constantinides P.Chkaarvarti RN.Rabbit arterial thrombosis production by systemic procedures［J］.Arch Pathol，1961，72：197－208.

［4］Abela GS，Picon PD，Friedl SE，etal.Triggering of plaque disruption and arterial thrombosis in an atherosclerotic rabbit model［J］.Circulation，1995，91：776－784.

［5］Slager CJ，Wentzel JJ，Gijsen FJ，etal.The role of shear stress in the generation of rupture－prone vulnerable plaques［J］.Nat Clin Pract Cardiovasc Med，2005，2：401－407.

［6］Prediman K，Shah MD，FACC.Mechanisms of plaque vulnerability and rupture［J］.J Am Coll Cardiol，2003，41（4）：15－22.

［7］Orbe J，Femandez L，Rodriguez JA.Different expression of MMPs／TIMP－1in human atherosclerotic lesion.Relation to plaque features and vascular bed［J］.Atherosclerosis，2003，170（2）：269－276.

［8］Beaudeux JL，Giral P，Bruckert E，etal.Matrix metalloproteinases，inflammation and atherosclerosis：Therapeutic perspectives［J］.Clin Chem Lab Med，2004，42（2）：121－131.

［9］Roui M，Adamy C，Duverger N，etal.Adenovirus－mediated overexpression of tissue inhibitor of metalloproteinase－1reduces atherosclerotic lesions in apo－lipoprotein E deficient mice［J］.Circulation，1999，100（2）：533－540.

［10］Chieh Chang，Zena Werb.The many faces of metalloproteases：Cell growth，invasion，angiogenesis and metastasis［J］.Cell Biology，2001，11（11）：S37－S43.

［11］Miyoshi A，Kitajima Y，Sumi K，etal.Snail and SIP1increase cancer invasion by upregulating MMP family in hepatocellular carcinoma cells［J］.Br J Cancer，2004，90（6）：1265－1273.

［12］Prediman K，Shah.Inflammation and plaque vulnerability［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2009，23：31－40.