益氣養(yǎng)陰活血方對病毒性擴(kuò)張型心肌病小鼠TNF－αmRNA表達(dá)的影響1）

安 靜，陳會君

本研究根據(jù)慢性心肌炎及早期擴(kuò)張型心肌病（DCM）患者之氣陰兩虛、瘀血阻滯、熱毒殘留的癥候特點。觀察益氣養(yǎng)陰活血方對小鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化及心肌組織腫瘤壞死因子－α（TNF－α）的影響，初步揭示作用機制，為中醫(yī)藥早期治療DCM提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 210只雄性Balb／c小鼠，體重10g，3周～4周齡，由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。分籠飼養(yǎng)，每籠10只室溫（26±3）℃，均食用普通飼料。

1.2 病毒 柯薩奇B3m（CVB3m）病毒（Nancy株，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)克山病研究所），在Hela細(xì)胞中傳代，凍融3次，離心（2 000r／min，10min），上清液分裝，在 Hela細(xì)胞中測50%組織感染率（TCID50）為10－7，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗用藥 益氣養(yǎng)陰活血組方：黃芪、紅參、生地、麥冬、五味子、川芎、丹參、蘭根、大青葉、桔梗、升麻、遠(yuǎn)志、柏子仁、合歡皮。中藥經(jīng)水提取，制成浸膏，含水量為21%。用蒸餾水稀釋，調(diào)整濃度為82%，即相當(dāng)于每毫升懸液中含生藥4.3g備用。黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)制劑室提供。生產(chǎn)日期：20051108。

1.4 主要試劑 試劑盒TrizolRNAIsolation、反轉(zhuǎn)錄試劑盒由美國Invitrogen公司提供、TaqDNA聚合酶由大連寶生物有限公司提供。PCR Marker試劑盒由美國Promega公司提供。PCR引物，應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer5.0設(shè)計引物，上海捷倍思基因有限公司合成。詳見表1。

表1 PCR引物序列

1.5 模型制備及分組 3周～4周齡雄性Balb／c小鼠共210只，自然光線，自由飲水，自由攝食條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。1周后，其中180只Balb／c小鼠隨機分為4組：正常對照組、模型組，中藥高、低劑量組。正常對照組30只，模型組，中藥高、低劑量組各60只。中藥高劑量組、中藥低劑量組、模型對照組均于實驗的1d、8d、15d、22d、36d、50d分別予腹腔注射 RM1640液稀釋的0.1mL10－4TCID50CVB3m、0.1mL 10－3TCID50CVB3m、0.2 mL10－3TCID50CVB3m、0.1mL10－3TCID50CVB3m、0.1 mL10－4TCID50CVB3m、0.1mL10－4TCID50CVB3m。正常對照組分別于實驗同期注射同體積的RM1640液。

1.6 給藥方法 各組均于末次病毒注射后10d，即實驗的第60天開始灌胃。中藥低、高劑量組均給予益氣養(yǎng)陰活血方混懸液灌胃，劑量分別為10.35g／（kg·d）及20.7g／（kg·d），以上給藥劑量均為生藥量。模型對照組和正常對照組灌以同體積蒸餾水。每日1次灌胃，連續(xù)4周。

1.7 取材 稱重后將小鼠用頸椎脫臼的方式處死，置入盛70%乙醇的燒杯中，使其體毛完全潤濕。小鼠置于70%乙醇潤濕紙巾，剪開將腹部皮膚，無菌取出心臟，將血液拭干，稱重后取1／2投入液氮罐中，－70℃低溫冰箱保存，備反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)RT－PCR）mRNA檢測。

1.8 檢測指標(biāo)及方法 RT－PCR法檢測心肌組織腫瘤壞死因子mRNA表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0軟件分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組均數(shù)間比較用方差分析，兩兩比較用q檢驗。等級資料組間比較應(yīng)用秩和檢驗。樣本率比較用χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠心肌組織TNF－αmRNA電泳條帶比較 TNF－α mRNA在瓊脂糖電泳凝膠上紫外燈下觀察均可見653bp片段，但各組電泳條帶亮度有明顯差異。各組β－actin電泳條帶亮度一致，擴(kuò)增片段均為432bp。

2.2 小鼠心肌組織TNF－αmRNA電泳產(chǎn)物灰度掃描值變化（見表2） 與正常組相比，模型組、中藥組小鼠TNF－αmRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，中藥高、低劑量組TNF－αmRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；中藥高劑量組與中藥低劑量組相比，心肌組織TNF－αmRNA表達(dá)降低的更明顯（P＜0.01）。

表2 TNF－αmRNA電泳產(chǎn)物灰度值變化比較（±s）

表2 TNF－αmRNA電泳產(chǎn)物灰度值變化比較（±s）

組別 n TNF－α／β－actin正常對照組 28 0.003 0±0.000 8模型組 33 0.385 7±0.092 21）中藥低劑量組 39 0.216 6±0.034 31）2）中藥高劑量組 29 0.186 3±0.019 11）2）3）與正常對照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01；與低劑量比較，3）P＜0.01

3 討 論

在病毒性心肌炎發(fā)病及其向擴(kuò)張型心肌病演變的過程中，心肌細(xì)胞及浸潤心肌的巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，以及心肌組織中的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等均可合成并釋放腫瘤壞死因子[1，2]。生理情況下，TNF－α具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、促進(jìn)細(xì)胞生長分化、參與機體免疫應(yīng)激反應(yīng)及抗病毒等多種生物活性，但當(dāng)它們過度產(chǎn)生或長期存在于心肌組織中時，也會對心臟結(jié)構(gòu)和功能造成不利影響。注射外源性重組人TNF－α?xí)剐募〖?xì)胞病毒含量增高，心肌壞死及細(xì)胞浸潤更嚴(yán)重，心肌炎加重。而抗TNF－α抗體能改善其心肌損害，延長存活時間[3]。TNF是病毒性心肌炎發(fā)病機制中致心肌損傷的重要因素之一。在非應(yīng)激狀態(tài)下時，正常的心肌組織是不合成及釋放TNF－α，與本實驗中正常對照組小鼠心肌組織中TNF－αmRNA的情況一致。而和正常組小鼠比較，其余各組小鼠心肌組織TNF－αmRNA表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）。益氣養(yǎng)陰活血方能明顯抑制小鼠心肌組織TNF－αmRNA的表達(dá)，減輕由TNF－α所引發(fā)的一系列免疫反應(yīng)，減輕心肌病理形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的改變，且以中藥高劑量組的作用最為明顯。益氣養(yǎng)陰活血方的作用機制可能是：早期通過降低心肌TNF－α含量，以減緩炎癥細(xì)胞的聚集，活化和炎癥介質(zhì)的釋放、減輕心肌組織的炎性病變。后期抑制心肌成纖維細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞增生，減緩心肌膠原酶、蛋白酶的合成，防止心肌組織異常增生、肥大及纖維化，減輕DCM的病理損傷[4，5]。通過抑制TNF－α對心肌細(xì)胞主要MHC－Ⅱ類抗原異常表達(dá)的誘導(dǎo)功能，從而阻斷T細(xì)胞介導(dǎo)的一系列自身免疫反應(yīng)。減輕了對心肌細(xì)胞的損害，改善了心肌組織的功能，延緩了慢性心肌炎向DCM發(fā)展的進(jìn)程，對早期擴(kuò)張型心肌病起到了較好的治療作用。

[1]王哲，楊繼紅，張臘蒲.參麥注射液合用1，6二磷酸果糖治療小兒病毒性心肌炎療效觀察[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2007，5（5）：440－441.

[2]程志清，張娟，劉宏飛.清心Ⅱ號對病毒性心肌炎急性期小鼠Th細(xì)胞分化與凋亡干預(yù)作用的研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6（1）：44－46.

[3]王再謨，傅榮周，唐章全.現(xiàn)代中藥臨床應(yīng)用[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：259.

[4]程志清，張娟，劉宏飛.清心Ⅱ號對病毒性心肌炎急性期小鼠Th細(xì)胞分化與凋亡干預(yù)作用的研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6（1）：44－46.

[5]程志清，張娟，劉宏飛.清心Ⅱ號對病毒性心肌炎急性期小鼠Th細(xì)胞分化與凋亡干預(yù)作用的研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6（1）：44－46.