注射用七葉皂苷鈉無(wú)菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證

陳曉寧

（山東綠葉制藥有限公司，山東煙臺(tái) 264003）

注射用七葉皂苷鈉的主要成分為七葉皂苷鈉A和七葉皂苷鈉B，是從七葉樹(shù)科植物天師栗的干燥成熟種子中提取的一種含酯鍵的三萜皂苷，適用于腦水腫、創(chuàng)傷或手術(shù)所致腫脹，也用于靜脈回流障礙性疾病。本實(shí)驗(yàn)按照《中國(guó)藥典》2005年版要求對(duì)注射用七葉皂苷鈉現(xiàn)行檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證，以期建立注射用七葉皂苷鈉的無(wú)菌檢查方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HTY-2000A 智能集菌儀；一次性全封閉集菌培養(yǎng)器（DGB220、DGB330），分別由杭州高得、泰林醫(yī)療器械廠(chǎng)生產(chǎn)。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，CMCC（B）26003]，銅綠假單胞菌[Pseudomonas aeruginosa，CMCC（B）10104]，枯草芽孢桿菌 [Bacillus subtilis，CMCC （B）63501]， 生孢梭菌[Clostridium sporogenes，CMCC（B）64941]，白色念珠菌[Candida albicans，CMCC（F）98001]，黑曲霉[Aspergillus niger，CMCC（F）98003]，以上均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.3 培養(yǎng)基

商品脫水培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨均由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司提供。

1.4 稀釋液和沖洗液

稀釋液和沖洗液均采用0.1%蛋白胨水溶液。

1.5 試藥

注射用七葉皂苷鈉（批號(hào)：200809042，規(guī)格：5 mg；批號(hào)：200811234，規(guī)格：10 mg；批號(hào)：200804124，規(guī)格：15 mg，檢品數(shù)量：120 支/批，山東綠葉制藥有限公司）。供試品藥液（注射用七葉皂苷鈉用0.1%蛋白胨水溶液進(jìn)行溶解、稀釋?zhuān)?/p>

2 方法與結(jié)果

潔凈度為100 級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，其環(huán)境潔凈度10 000 級(jí)。檢驗(yàn)全過(guò)程嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。

2.1 菌液制備[1-2]

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48 h，上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每毫升含菌數(shù)小于100 cfu（菌落形成單位）的菌懸液。

接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23～28℃培養(yǎng) 5～7d，加入 3～5 ml 0.9%無(wú)菌氧化鈉溶液，將孢子洗脫，然后，吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無(wú)菌紗布能過(guò)濾菌絲的無(wú)菌毛細(xì)吸管）至無(wú)菌試管內(nèi)，用0.9%無(wú)菌氧化鈉溶液制成每毫升含孢子數(shù)小于100 cfu 的孢子懸液。

2.2 方法驗(yàn)證

按《中國(guó)藥典》2005年版[3]規(guī)定，取規(guī)定量的供試品按薄膜過(guò)濾法溶解、過(guò)濾、沖洗。過(guò)濾前先用少量沖洗液濕潤(rùn)濾膜。過(guò)濾時(shí)，保持供試液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。將濾器中的溶液搖勻。每張濾膜每次沖洗量為100 ml，流速不易過(guò)快（以泵速為30～140 r/min 為宜），在最后一次的沖洗液中加入小于100 cfu 的試驗(yàn)菌，過(guò)濾。將硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，白色念珠菌、黑曲霉接種于改良馬丁培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基加入量為100 ml/筒。陽(yáng)性對(duì)照：另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為對(duì)照。按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5d。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置30～35℃培養(yǎng)，改良馬丁培養(yǎng)基置23～28℃培養(yǎng)。各試驗(yàn)菌同法操作。陰性對(duì)照：取一套DGB220 濾器置于集菌儀上，取稀釋劑200 ml，與供試品同法操作，濾過(guò)。注入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基各100 ml，作為陰性對(duì)照。

2.3 結(jié)果

培養(yǎng)結(jié)果與對(duì)照管比較（如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，則供試品的檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)），本品各容器中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，照此檢查法和檢驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的無(wú)菌檢查[4-6]。注射用七葉皂苷鈉無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果，見(jiàn)表1～3。

表1 注射用七葉皂苷鈉實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

上述結(jié)果表明，本品按《中國(guó)藥典》2005年版二部進(jìn)行無(wú)菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證，與對(duì)照管比較，含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，表明在上述試驗(yàn)方法下該樣品對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌無(wú)抑菌作用或其抑菌作用忽略不計(jì)，符合《中國(guó)藥典》2005年版無(wú)菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證規(guī)定。所以注射用七葉皂苷鈉的無(wú)菌檢查可以用0.1%蛋白胨水溶液作為稀釋液和沖洗液，可以用薄膜過(guò)濾法檢驗(yàn)，沖洗量為100 ml/膜。

表2 注射用七葉皂苷鈉實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 注射用七葉皂苷鈉實(shí)驗(yàn)結(jié)果

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