炮制對(duì)葛根中總黃酮及葛根素含量的影響

吳 可，謝朝暉 ，王 芳

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，湖南長(zhǎng)沙 410007)

葛根為豆科植物野葛[Pueraria lobata(wild)Ohwi]的干燥根，性涼、味甘、辛。具有解肌退熱、生津透疹、升陽止瀉的功效。生葛根擅于解肌退熱、透疹生津；麩煨品發(fā)散作用緩和，增強(qiáng)止瀉的作用[1]。葛根主要含有黃酮類物質(zhì)20 余種及葛根苷類、三萜類等成分[2]。藥理研究表明，葛根總黃酮和葛根素具有使冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張、降低心肌耗氧量、改善微循環(huán)、解痙及降壓等作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)葛根采用不同炮制方法下總黃酮和葛根素的含量進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-9200 紫外可見分光光度計(jì) （北京瑞利分析儀器公司）；DHG101 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （鞏義市英峪予華儀器廠）；SK3300H 超聲提取器 （上海科學(xué)超聲儀器公司）；AR1140分析天平（奧豪斯國(guó)際貿(mào)易公司）。

1.2 試藥

葛根飲片購(gòu)于湖南省邵陽市廉橋藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為野葛[Pueraria lobata（wild）Ohwi]的干燥根。葛根素（批號(hào)：0752-9605，湖南省藥品檢定所），硅膠gF254（批號(hào)：050630，青島海洋化工廠），其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

2.1.1 生葛根 取葛根片，凈制，粉碎，過二號(hào)篩，為1 號(hào)粉。

2.1.2 麥麩煨制[3]按文獻(xiàn)將葛根片煨至呈焦黃色時(shí)取出，篩去麥麩（麥麩用量為每100 克葛根用麥麩30g），放涼，粉碎，過二號(hào)篩，為2 號(hào)粉。

2.1.3 麥麩烘制[4]取100g 葛根片置方盤中，上下各鋪一層麥麩，烘制條件為：165℃、40 min 取出放涼 （麥麩用量為每100 克葛根用麥麩30g），粉碎，過二號(hào)篩，為3 號(hào)粉。

2.2 含水量測(cè)定[5]

分別稱取1、2、3 號(hào)粉約1g，精密稱定，平鋪于干燥至恒重的稱量瓶中，開蓋，置干燥箱中，在105℃ 干燥5 h，將瓶蓋好，轉(zhuǎn)移至干燥器中冷卻30 min，精密稱定重量，再于105℃干燥1 h，冷卻，稱重，至連續(xù)兩次稱重差異不超過5 mg為止，根據(jù)減少的重量計(jì)算供試品含水量，結(jié)果見表1。

表1 生品與制品含水量測(cè)定結(jié)果Tab.1 determination result of moisture in Pueraria lobata Ohwi and preparation Pueraria lobata Ohwi

2.3 醇溶性浸出物的測(cè)定[5]

分別取供試品約2g，精密稱定，置250 ml 的錐形瓶中，精密加95%乙醇50 ml，密塞，稱定重量，靜置1h 后，連接回流，加熱至沸騰，并保持微沸1 h，放冷后，精密稱定重量，用水補(bǔ)足減失重量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 ml，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定。結(jié)果見表2。

表2 醇溶性浸出物含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Contentdetermination results of ethanol-soluble extractives

2.4 總黃酮含量的測(cè)定[6-7]

2.4.1 線性關(guān)系考察 取干燥至恒重的葛根素標(biāo)準(zhǔn)品約5 mg，精密稱定，置25 ml 量瓶中，用95%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻， 精密吸取 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml分別置 10 ml 量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，搖勻，在251 nm 處測(cè)定吸光度，以濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=0.062 4C+0.001 0（r=0.997 9），結(jié)果表明，葛根素在4.008～12.024 μg/ml 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度 取“2.4.1”項(xiàng)下已配得葛根素濃度為8.016 μg/ml的溶液，共5份，按“2.4.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD為0.36%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)分別稱取1、2、3 號(hào)粉，共 6份，按“2.4.6”項(xiàng)下方法操作，在相同條件下測(cè)定，計(jì)算得總黃酮含量量分別為 0.676、0.810、0.874g，符合要求。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1、2、3 號(hào)粉適量，按“2.4.6”項(xiàng)下方法操作，分別在 0、2、4、8、12、24h 進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得總黃酮含量分別為3.09%、3.55%、3.79%。結(jié)果表明，溶液在24h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品液5份，分別置5個(gè)10 ml 量瓶中，分別加入5 ml 已測(cè)定濃度為4.008 μg/ml的樣品液，用95%乙醇定容至刻度，搖勻，在251 nm 處測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，加樣回收率計(jì)算公式：回收率=（加入純品后的測(cè)得總量-樣品中所含被測(cè)成分量）/加入純品量，結(jié)果見表3。

表3 總黃酮加樣回收率試驗(yàn)（n=5）Tab.3 Results of recovery test of total flavonoids(n=5)

2.4.6 樣品含量測(cè)定分別稱取1、2、3 號(hào)粉約25g， 精密稱定，放入500 ml 圓底燒瓶中，加80%乙醇150 ml 溶解，先超聲20 min，再熱回流提取30 min，提取3次[8]，抽濾洗滌，合并3次濾液，搖勻，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中濃縮至干，放入烘箱中干燥至恒重，分別取3 種提取物約30 mg，精密稱定，分別置50 ml量瓶中，用95%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，再分別取1 ml置3個(gè)50 ml 量瓶中，用95%乙醇溶解并定容至刻度，以空白溶劑作對(duì)照，在251 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總黃酮的含量，結(jié)果見表4。

表4 各供試品總黃酮含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.4 Contentdetermination results of total flavonoids indifferent sample（n=3）

2.5 葛根素的含量測(cè)定[8]

2.5.1 線性關(guān)系考察 取葛根素對(duì)照品約1.5 mg，精密稱定，置25 ml 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.9、1.0、1.1、1.2、1.3 ml分別置 10 ml 量瓶中，各加甲醇至刻度，搖勻，以甲醇為空白對(duì)照液，在251 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=0.080 5C+0.048 3（r=0.997 6），結(jié)果表明葛根素在1.248～6.240 μg/ml 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn)分別稱取1、2、3 號(hào)粉，共6份，按供試品溶液制備方法操作，在相同條件下測(cè)定，計(jì)算得葛根素平均質(zhì)量分別為 0.398、0.555、0.606g，符合要求。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取 1、2、3 號(hào)供試品溶液分別在 0、2、4、8、12、24h 進(jìn)樣，在上述條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得葛根素含量分別為1.82%、2.43%、2.64%。結(jié)果表明，溶液在24h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.4 加樣回收率試驗(yàn) 按 “2.5.5”項(xiàng)下方法操作，取濃度為4.008μg/ml 對(duì)照品溶液，共5份，分別加入已知濃度為5.407μg/ml、體積為9 ml 的樣品溶液中，以95%乙醇為空白溶液，在251 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，根據(jù)回歸方程計(jì)算回收率。得平均回收率為98.06%，RSD=0.31%（n=5）。結(jié)果見表5。

表5 葛根素加樣回收率試驗(yàn)（n=5）Tab.5 Results of recovery test of puerarin(n=5)

2.5.5 樣品含量測(cè)定

2.5.5.1 薄層層析板制備[8]取硅膠H 加0.5%CMC-Na 溶液，混勻，濕法制板，涼干后，105℃活化0.5 h，備用。

2.5.5.2 供試品溶液制備分別取1、2、3 號(hào)粉提取物約30 mg，精密稱定，分別置3個(gè)50 ml 量瓶中，超聲20 min，使提取物充分溶解，分別取1 ml 置3個(gè)50 ml 量瓶中，分別定為1、2、3 號(hào)供試品溶液，備用。

2.5.5.3 葛根素含量測(cè)定[9]用進(jìn)樣器精密取葛根素標(biāo)準(zhǔn)液及1、2、3 號(hào)供試液各10 μl 點(diǎn)樣于制備好的薄層板上， 以三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25）配制展開劑，將展開劑倒入展開槽中，再把點(diǎn)好供試液的薄層板放入展開槽中，先不接觸展開劑，使薄層板飽和15 min 后，再放入展開劑中進(jìn)行展開，展開約10 cm 后取出，噴適量氨水于薄層板，在紫外燈下365 nm處，根據(jù)熒光畫定斑點(diǎn)位置，刮下斑點(diǎn)于具塞試管中，加5 ml甲醇，超聲20 min，再離心10 min，倒出溶液，以甲醇為空白對(duì)照液，在251 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，代入回歸方程，計(jì)算樣品中葛根素含量，結(jié)果見表6。

3 討論

實(shí)驗(yàn)表明，水分含量生品最高，麩烘品最低，依次為生品＞麩煨品＞麩烘品，說明炮制后更干燥，有利于儲(chǔ)存。醇溶性浸出物以生品最高，麩烘品最低，分別是生葛根＞麩烘品＞麩煨品，表明葛根經(jīng)麩烘或麩煨后不利于醇溶物的溶出，提示麩烘或麩煨可能對(duì)醇溶性成分有破壞。

表6 各供試品中葛根素含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.6 Contentdetermination results of Puerarin indifferent samples（n=3）

從總黃酮和葛根素含量的測(cè)定結(jié)果可以看出，生葛根、麩煨品及麩烘品的總黃酮含量分別為3.09%、3.54%、3.78%；葛根素含量分別為1.81%、2.43%、2.62%；結(jié)果表明，葛根經(jīng)加熱炮制后總黃酮及葛根素含量均高于生品，麥煨品略低于麩烘品，可能與樣品處理程度有關(guān)。

葛根臨床應(yīng)用生熟有別，從已知的作用成分來看，用于心血管系統(tǒng)以麩煨較好，但根據(jù)中醫(yī)藥理論，煨后發(fā)散作用減弱，止瀉作用增強(qiáng)，其炮制原理有待于進(jìn)一步研究。

[1]葉定紅,張世臣.中藥炮制學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:393.

[2]王浩生,鄧文龍,薛春生.中藥藥理與應(yīng)用[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2004:1146.

[3]龔千峰,丁安偉,孫秀梅,等.中藥炮制學(xué)[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2003:360.

[4]解統(tǒng)新.淺談葛根炮制[J].山東中醫(yī)雜志,2003,22(8):496.

[5]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:附錄ⅨH,附錄ⅩA,附錄ⅪB.

[6]周國(guó)海,于華忠,李國(guó)章,等.葛根中總黃酮及葛根素的含量測(cè)定[J].湖南林業(yè)科技,2004,31(5):71-72.

[7]彭欣榮,李璞.RP-HPLC 法測(cè)定保健品葛根粉中葛根素的含量[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2007,18(3):177-178,183.

[8]楊振林,寇玉璽,李紅舉.紫外分光光度法測(cè)定葛根沖劑中葛根素含量[J].醫(yī)療論壇學(xué)報(bào),2005,26(6):57.

[9]彭菊艷,王俊儒,張義英,等.葛根有效成分的含量測(cè)定與提取工藝優(yōu)化[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,(3):52-54.