高效液相色譜－串聯質譜法研究環維黃楊星D分散片的生物利用度＊

陳日來，李玉珍，謝守霞，李 東，王大果，李衡梅

(1.廣東省深圳市福田區第二人民醫院，廣東 深圳 518049; 2.廣東醫學院附屬福田醫院，廣東 深圳 518033;3.暨南大學第二臨床醫學院，深圳市人民醫院，廣東 深圳 518020)

環維黃楊星D(cyclovirobuxine D，CVB－D)又稱黃楊寧、環常綠黃楊堿D、黃楊堿等，是從黃楊木中提取的生物堿，屬孕甾烷衍生物，分子式為C26H46N20，具有行氣通絡止痛功能，主要用于治療氣滯血瘀所致胸痹心痛、脈結代、冠心病、心律失常[1]。CVB－D是繼麻黃素和青蒿素之后，從我國中藥寶庫中發掘出來的又一個具有劃時代意義的單體化合物，有良好的應用前景[2]。但有關CVB－D在犬、兔、大鼠和人體內的藥代動力學研究[3－12]提示，其不同劑型的相同劑量在同一物種中的藥代動力學參數個體差異非常大;黃楊寧用于治療冠心病心絞痛具有即時療效，但血藥濃度極低。因此，在黃楊寧的新型制劑研究中，建立靈敏度高的測定方法并研究其藥代動力學規律，對于制劑療效穩定性與用藥安全評價等均具有重要的意義。筆者應用高效液相色譜－串聯質譜(HPLC－MS2)法，建立了簡便靈敏地測定生物樣品中CVB－D的方法，并研究了其分散片與普通片的相對生物利用度，為分散片的臨床應用提供了參考依據。

1 材料與試藥

Thermo Finnigan LCQ液質聯用儀(帶自動進樣器和Xcalibur軟件);Allegra 64R型離心機(美國貝克曼庫特有限公司)。CVB－D對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為888－200202，純度大于94%);內標左羥丙哌嗪對照品(深圳海王藥業有限公司，批號為05021011，純度大于99%);有機溶劑均為色譜純，去離子水由Purelab classic純水系統(ELGA Labwater，France)制備。受試制劑CVB－D分散片(自制，批號為091101，規格1 mg/片);參比制劑黃楊寧片(南京小營制藥廠，批號為2010612，規格1 mg/片)。

2 方法與結果

2.1 色譜及質譜條件

色譜柱:Hyperity C18柱(150 mm ×2.1 mm，5 μm)，柱溫:40 ℃;流動相:10 mmol甲酸銨－甲醇－0.1%甲酸(20∶50∶30);流速:0.2 mL/min;自動進樣器溫度:4℃。電噴霧(ESI+)方式檢測(能量級為28%);噴霧電壓:5 kV;毛細管溫度:300℃;鞘氣流以及輔氣流分別為35和5，用于定量分析的離子對分別為 m/z 403.0→372.2(CVB － D)和 m/z 235.3→219.1(內標)。

2.2 樣品處理方法

取血漿1 mL，加100 μL質量濃度為43.6 pg/mL內標，再加入50 μL 50%的氨水，混勻 20 s，加入 5 mL三氯甲烷，震蕩 3 min，以2 600 r/min離心10 min，取下清液3.5 mL，置干凈玻璃管，于40℃水浴氮氣吹干，最后殘渣用100 μL流動相溶解，進樣20 μL。

2.3 方法學考察

專屬性考察:空白血漿、空白血漿加對照品和用藥后血漿樣品色譜圖見圖1。可見，CVB－D、左羥丙哌嗪的保留時間分別為2.7 min和3.0 min左右，血漿中內源性物質不干擾測定，專屬性強。ESI+條件下質譜掃描見圖2。

圖2 質譜掃描圖

標準曲線繪制:配制含CVB－D質量濃度分別為 10，20，40，80，120，160，320 pg/mL 的血漿樣品，按 2.2項下方法處理。以 CVB－D峰面積與內標峰面積之比(Y)為縱坐標、血漿中CVB－D質量濃度(C)為橫坐標制作標準曲線。得回歸方程Y=0.000 308 625 C+0.001 84909，r=0.996 9(n=7)，權重系數為1/X。結果表明，CVB－D質量濃度線性范圍是10～320 pg/mL，最小檢出質量濃度為10 pg/mL。

精密度試驗:分別配制CVB－D低(20 pg/mL)、中(80 pg/mL)、高(160 pg/mL)3個質量濃度的質控樣品，每個質量濃度制備5份，分別在3 d內連續測定其質量濃度，計算日內、日間誤差。結果見表1，可見方法有較高的精密度和準確度。

表1 精密度試驗結果(n=5)

穩定性試驗:根據樣品采集及分析過程，同時考察了低、中、高3個質量濃度的質控樣品分別在－20℃(30 d)、室溫(8 h)、4℃(12 h)、反復凍融(3次)狀態下的穩定性，每個濃度制備5份樣品，以測得的準確度表示穩定性。結果準確度在92%～108%，表明樣品在各種條件下保存均有良好的穩定性。

回收率試驗:結果見表2。可見，CVB－D和內標的平均萃取回收率大于85.33%，平均方法回收率在94.30% ～104.43%之間。

基質效應考察:取離心管數支，加入1 mL空白血漿，按2.2項下方法處理，空白血漿來自6個不同個體。另取離心管數支，用純水代替空白血漿后同法操作。計算血漿萃取物和純水萃取物的平均峰面積比值，考察基質效應的影響。結果顯示，基質對濃度信號的影響在 0.91 ～3.46%之間。

表2 回收率試驗結果(n=5)

2.4 統計學方法

2.5 人體生物利用度試驗

試驗設計:試驗方案報醫學倫理委員會審批通過。健康男性志愿者 18 人，平均年齡(23.2 ±1.5)歲，平均體重(62.6 ±7.6)kg，平均體重指數(BMI)為(21.4±1.7)。所有受試者試驗前常規體格檢查和血液生化檢查示肝臟、腎臟功能基本正常。受試期間及試驗前停服所有藥物，禁煙、酒。試驗前受試者均簽署知情同意書。受試者于試驗日的前晚開始禁食12 h，第2天早晨7:30空腹開始試驗。采用自身對照、隨機交叉的方法，分別一次性口服受試藥CVB－D分散片2片(規格為1 mg/片)或對照藥黃楊寧片2片(規格為1 mg/片)，用200 mL溫開水送服，服藥后禁食2 h，前后兩次給藥間隔時間為 2 周。服藥前和服藥后 0，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，10，12，24，48，72，120，144 h 共 16 個時間點從前臂靜脈取血，每次取血4 mL，分離血漿貯存于－20℃冰箱，待分析。所有的受試者試驗期間未見其他不良反應，試驗結束后復查肝腎功能均基本正常。

結果:血藥濃度－時間曲線見圖3。藥代動力學參數見表3。單劑量給藥后，將受試藥與對照藥的 Cmax，AUC0－t，AUC0－∞進行方差分析，結果顯示在制劑間均無顯著性差異(P＞0.05)，服藥周期亦無明顯影響(P ＞ 0.05)，但個體間存在明顯差異(P ＜ 0.01)。統計結果顯示，AUC0－t的置信區間 為 84.5% ～112% ，AUC0－∞的置信區間為88.9% ～105%，Cmax的置信區間為93%～108% ，均符合等效標準;Cmax，AUC0－t，AUC0－∞的雙向 t檢驗結果同樣符合等效標準;tmax經非參檢驗，結果合格。因此，受試藥與對照藥具有生物等效性。

圖3 血藥濃度－時間曲線

3 討論

與已有的方法[13]比較，本研究建立的測定方法檢測靈敏度高、樣本量少、分析時間短，CVB－D和內標的保留時間分別為2.0 min和2.7 min左右，大大縮短了分析時間，適合大批量樣本的分析處理。含CVB－D的血漿需經堿化后再用有機溶劑提取，經考察發現，堿量適當加大，有利于提取完全，因此用50%的氨水進行堿化，再分別用5 mL乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、三氯甲烷提取。結果表明，用三氯甲烷提取，基線噪音低，提取回收率較高，溶劑易揮干。根據CVB－D的結構特征，篩選了許多內標物，結果以左羥丙哌嗪為內標物，峰形好，與被測物及血漿中內源性物質分離完全，測定結果準確。

表3 主要藥代動力學參數(±s，n=18)

表3 主要藥代動力學參數(±s，n=18)

藥動學參數AUC0－36(ng·h/mL)AUC0－∞ (ng·h/mL)Cmax(ng/mL)tmax(h)t1/2(h)F(%)受試制劑5 679.83 ± 1 548.21 7 464.21 ± 2 128.08 202.81 ± 43.30 5.76 ± 1.93 54.67 ± 12.43 99.4 ± 8.3參比制劑5 243.65 ± 1 317.39 7 021.43 ± 2 076.12 222.10 ± 50.90 5.22 ± 1.03 50.66 ± 13.63

人血漿中藥物濃度測定結果表明，兩種不同劑型的CVB－D在給藥后4 h血藥濃度達到最大，給藥后約48 h出現較明顯的血藥濃度回升的雙峰現象，考慮為腸肝循環的原因。本研究結果顯示，藥物的分布較迅速，消除速率較慢。由此可見，CVB－D在人體內作用維持時間較長，有利于心血管疾病的治療。

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