河南漢族人群6q24-25.1區域STR基因座的遺傳多態性

張建勛，樂曉萍，楊 洋，朱運良

鄭州大學基礎醫學院法醫學教研室鄭州450001

(2010-11-04收稿 責任編輯 李沛寰)

微衛星DNA又叫短串聯重復序列(short tandem repeat，STR)，作為第二代遺傳標記，在上世紀80年代末期之后廣泛應用于疾病基因的定位克隆，其在腫瘤細胞染色體不穩定性的研究、人類及其基因組的進化和法醫學等方面也具有不可替代的作用［1-2］。許多腫瘤細胞在6號染色體長臂上發生雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)。6q21、6q23-24、6q24-25、6q27 等是幾個 LOH 的熱點區域［3-6］。為了進一步精細定位這些缺失區域，需要更多的相距更近的STR基因座。作者對河南漢族人群6q24-25.1區域共11 Mb范圍內STR基因座的多態性進行研究，為其進一步在法醫學和復雜疾病基因的定位等方面的應用提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 120例河南漢族無關個體的血液樣本采集于2008年5月，來自鄭州市中心血站。其中男65例，女55例。

1.2 微衛星的查找和引物的設計 從GenBank上下載6q24-25.1區域的DNA，序列從139 000 000～150 000 000，用Tandem Repeats Finder在線軟件在這段DNA序列上共查找到了14個STR基因座，平均間距為700 kb，重復單位為四核苷酸，這14個STR基因座的基本參數見表1。再用Primer3軟件設計這些STR基因座的PCR引物，使擴增產物大小在300 bp以內，引物序列見表2。引物由上海生工生物工程技術服務公司合成。

1.3 PCR擴增 取血樣，采用酚-氯仿法提取DNA，－20℃保存。擴增體系20μL，內含DNA模板1 ng，上下游引物各 1.5 μL(5 μmol/L)，dNTP 0.4μL(10 mmol/L)，Taq聚合酶 1 U，10 ×Buffer(含 Mg2+1.5 mmol/L)2 μL，ddH2O 12.6 μL。擴增條件:95℃預變性2 min;94℃ 35 s，62℃ 45 s，72℃ 40 s，每一循環退火溫度降低0.5℃，共12個循環;然后94 ℃ 35 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，20個循環;最后72℃ 5 min，12℃保存。采用6 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，用銀染法顯示電泳條帶。然后檢測等位基因片段大小，用阿拉伯數字按從小到大的順序分別表示大小不同的等位基因。

表1 14個STR位點的基本參數

表2 14個STR基因座的引物序列

1.4 統計學處理 采用PowerStatsV12.xls(美國Promega公司)對14個STR基因座進行分析，可得到如下常用參數:多態信息含量(polymorphic information content，PIC)，雜合度(heterozygosity，H)，個體識別率(discrimination power，DP)，匹配概率(match probability，MP)，非父排除率(excluding probability of paternity，PE)，父權指數(paternity index，PI)。

2 結果

2.1 等位基因及其基因頻率 120個無關個體6號染色體的14 個 STR 基因座分別檢出5、6、2、3、6、6、7、4、7、4、4、5、4、4 個等位基因，各等位基因頻率見表3。

2.2 14個STR基因座的群體遺傳學參數 14個STR基因座的群體遺傳學參數見表4。結果顯示:D6SZ2、D6SZ6、D6SZ7、D6SZ8、D6SZ9 和 D6SZ12 這6個STR基因座的H、PIC和DP較高。

表3 14個STR基因座等位基因頻率(n=120)

表4 14個STR基因座的群體遺傳學參數(n=120)

3 討論

人類腫瘤的發生是一個多步驟多基因異常積累的過程，包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活。抑癌基因失活的經典機制是Kundosn的二次打擊學說，可以用LOH來發現和定位新的候選抑癌基因。6q24-25區域是多種腫瘤 LOH 的熱點區域［3，7］。該研究在人類基因組6q24-25.1區域中共查找到了14個STR基因座，通過對河南漢族120例健康無關個體群體調查，得到了河南漢族人群這14個基因座的群體遺傳學數據。其中 D6SZ2、D6SZ6、D6SZ7、D6SZ8、D6SZ9和D6SZ12這6個STR基因座的PIC為0.57 ～0.65(＞0.50)，DP 為 0.803 ～0.857(＞0.80)，說明這6個STR基因座是一組良好的遺傳標記，適用于法醫學個體識別和親子鑒定。為將這些遺傳標記更好的用于法醫學實踐，還需進一步評估這些STR基因座在6號染色體是否存在連鎖不平衡，以便發現目的基因進行基因診斷［8］。

作者挑選四核苷酸重復的微衛星。與二核苷酸及三核苷酸重復微衛星相比，四核苷酸重復微衛星PCR擴增時不容易產生影子帶。微衛星的平均距離為700 kb。再加上數據庫中已公布的此區域的微衛星，就可以得到更為精細的微衛星圖，從而為此區域復雜疾病基因的定位候選克隆提供更為精細的物理圖。

對缺失區域的精細分析有助于了解缺失的機制及其與腫瘤發生的關系。hZAC基因是一個定位于6q24.2區域的新的候選抑癌基因［7］。有一個頻繁發生的區域被限定在hZAC基因周圍的D6S292-D6S310-D6S311之間，此區域已在乳癌中被鑒定［9］。根據人類基因組圖譜可知hZAC定位于6q24區域的D6S308和D6S978之間，物理位置為144 261 437～144 385 735 bp，恰好在該報道的D6SZ7和D6SZ8之間。作者希望用新查找到的這些高密度的多態性的微衛星標記將此區域定位于更精確的范圍，為進一步精確分析斷裂點打下基礎。

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