微流控技術(shù)與芯片實(shí)驗(yàn)室

趙亮 黃巖誼

(北京大學(xué)工學(xué)院 北京大學(xué)生物動態(tài)光學(xué)成像中心 北京 100871)

芯片實(shí)驗(yàn)室是lab-on-a-chip的直譯，它并不是一個精確定義的科學(xué)概念，而是一個新興的領(lǐng)域。原則上，所有生物與化學(xué)實(shí)驗(yàn)室功能的微型化手段均可以用芯片實(shí)驗(yàn)室技術(shù)來指代。芯片實(shí)驗(yàn)室概念中的代表性技術(shù)就是針對小尺度液體操控的微流控技術(shù)(microfluidics)。 除此之外，芯片實(shí)驗(yàn)室技術(shù)也包括了非流動的靜態(tài)微型實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，例如傳統(tǒng)定義中的生物芯片。這類芯片系統(tǒng)通常是微陣列芯片(micro-arrays)，如基因芯片、蛋白質(zhì)芯片等。它們的特點(diǎn)是流體的流量通常未被控制，可以認(rèn)為是微流控芯片的特殊類型。這類芯片一般通過檢測點(diǎn)陣上的不同反應(yīng)(如雜交或者蛋白相互作用等)來進(jìn)行分析，功能較為有限。相對而言,可以控制流體精確運(yùn)動的微流控芯片則具有更廣泛的類型、功能與用途。這一技術(shù)受到許多從事物理科學(xué)(物理學(xué)、化學(xué)、力學(xué)等)、生命科學(xué)以及工程科學(xué)的研究者的廣泛關(guān)注，被應(yīng)用到這些領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)研究中。本文主要介紹微流控芯片技術(shù)及其基本發(fā)展過程，著重介紹微流控芯片技術(shù)的最新研究進(jìn)展及其在化學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

在化學(xué)和生物學(xué)研究中，絕大部分實(shí)驗(yàn)都是在溶液狀態(tài)下進(jìn)行的。由于研究人員對化學(xué)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的液體體積要求越來越小，通量要求越來越高，對實(shí)驗(yàn)自動化與可操控性的要求也越來越迫切，傳統(tǒng)的承載和轉(zhuǎn)移操作液體的器材和工具(如燒杯、試管、培養(yǎng)皿等)已經(jīng)不再滿足科學(xué)工作者的需求。新型技術(shù)手段必須具備可操作更小體積的液體、更小型化的尺寸、更高的實(shí)驗(yàn)通量、更加自動化控制的特點(diǎn)。 微流控芯片就是一種在這樣的需求中應(yīng)運(yùn)而生的技術(shù)，用以進(jìn)行微量甚至是極微量液體的操控與分析。

從微流控芯片的發(fā)展歷史上看，這一技術(shù)的孕育和發(fā)展具有一定的必然性。科研市場和醫(yī)療的需求，加上在微電子領(lǐng)域的相關(guān)加工技術(shù)日漸成熟，催生了微流控芯片技術(shù)并加速了它的發(fā)展[1]。在醫(yī)療健康、檢驗(yàn)檢疫、環(huán)境監(jiān)測、勞動保護(hù)、司法鑒定等領(lǐng)域，對分子分析的需求越來越多，要求也越來越高。對分離分析技術(shù)如色譜和毛細(xì)管電泳手段的微型化，成為市場的實(shí)際需求。這一需求的背后，是龐大的醫(yī)療診斷消費(fèi)群體以及國家安全的需要。隨著分子生物學(xué)的研究日漸深入，更大通量和更低消耗的實(shí)驗(yàn)技術(shù)成為必需。微流控芯片技術(shù)正好代表了這種趨勢，符合現(xiàn)代分子生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等學(xué)科的發(fā)展步伐。20世紀(jì)后半葉迅速發(fā)展的微電子工業(yè)積累了大量的微加工經(jīng)驗(yàn)，這些經(jīng)驗(yàn)不僅使得許多微流控芯片加工所必需的理論和技術(shù)得以成熟，而且成型了許多相關(guān)設(shè)備和儀器，發(fā)明了許多相應(yīng)的新材料；同時，由于產(chǎn)業(yè)的推動和市場的不斷擴(kuò)大，加工成本也大大降低。

1975年，斯坦福大學(xué)的Terry等人[2]利用微加工手段，在一片硅晶片上蝕刻出了微細(xì)的管道，用作氣相色譜的色譜柱，進(jìn)行微量氣體分離分析的研究。這個器件可能是第一個現(xiàn)代意義上的微流控裝置。但是由于技術(shù)等因素的制約，這種芯片并未引起足夠廣泛的重視。隨后，微流控技術(shù)的發(fā)展進(jìn)入了相對遲滯的時期。1990年，Manz等人提出微全分析系統(tǒng)(micro total analysis system,μTAS)的概念[3],微流控芯片進(jìn)入快速發(fā)展時期。Manz和Harrison等進(jìn)行了深入合作，開展了一系列早期芯片毛細(xì)管電泳的開拓性研究工作[4]。這一時期，絕大多數(shù)芯片都是在硅和玻璃基底上制備的，直接借鑒微電子領(lǐng)域成熟的硅基微加工技術(shù)。1998年，G.M.Whitesides提出了軟蝕刻(soft lithography)技術(shù)的概念，從此宣告微流控芯片進(jìn)入了以彈性材料聚二甲基硅氧烷(poly (dimethlysiloxane),PDMS)為關(guān)鍵材料的時代[5]，微流控芯片技術(shù)又進(jìn)入了新一階段的快速發(fā)展時期。2000年，S.R.Quake 等在加州理工學(xué)院提出了一種基于PDMS材料的多層軟蝕刻技術(shù)(multilayer soft lithography)制作新型的氣動微閥和微泵的概念[6]。2002年10月,Quake研究組正式應(yīng)用氣動微閥技術(shù)以“大規(guī)模集成微流控芯片”為題在美國《科學(xué)》雜志上發(fā)表文章，介紹集成了上千個微閥和反應(yīng)器的微流控芯片[7]，標(biāo)志著芯片從簡單的電泳分離到大規(guī)模集成化的技術(shù)飛躍。如今微流控芯片已經(jīng)成為涵蓋了從分離分析、化學(xué)合成 、醫(yī)學(xué)診斷學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、微生物學(xué)等一系列應(yīng)用研究領(lǐng)域的綜合性交叉學(xué)科。

1 微流控芯片的加工與制備

微流控芯片技術(shù)從概念提出到誕生和發(fā)展，都離不開微加工技術(shù)。微加工技術(shù)的發(fā)展與微流控芯片的發(fā)展息息相關(guān)。另一方面，由于新材料應(yīng)用和發(fā)展，微加工本身的內(nèi)涵也得到了豐富。從早期微流控領(lǐng)域文獻(xiàn)可以看到，大部分探索是直接采用電子學(xué)上的基片材料如硅片、玻璃等作為基本的芯片制作材料。如今這些材料大多已經(jīng)被更為經(jīng)濟(jì)廉價的高分子塑膠材料代替。這種變化的主要原因在于許多時候硅片并不合適用作制作分離分析和液體操作的微流控芯片材料，因?yàn)樗煌该髑覄傂暂^大，難以與成熟的光學(xué)檢測平臺集成在一起；而玻璃的光學(xué)性能雖然較好，但要加工制作復(fù)雜的多層結(jié)構(gòu)比較困難，步驟相對繁瑣，而且要想制作對液體操控所必需的微泵和微閥是非常困難的。

1998年,哈佛大學(xué)的Whitesides課題組發(fā)明了利用彈性高分子材料PDMS的快速復(fù)制成型的微加工方法，用于微流控芯片制備，該方法被稱為軟蝕刻技術(shù)(soft lithography)[5]。相對于玻璃材料和硅材料，這種技術(shù)加工制作方便，無須特別苛刻的微加工條件和實(shí)驗(yàn)條件，一次制成的模板可以多次重復(fù)使用，極大地縮短了芯片制作所需的時間，加快了研究的速度，降低了芯片制作的難度和成本。這些優(yōu)點(diǎn)促使微流控芯片的研究進(jìn)入了一個快速發(fā)展的時期。

軟蝕刻技術(shù)的主要過程如圖1A所示。首先，微流控芯片圖形利用計(jì)算機(jī)圖形軟件設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)好的圖形通過高分辨率打印而得到掩膜，再將該光刻掩模通過光刻的方法將圖形轉(zhuǎn)移到涂有光膠的基底上。以SU-8負(fù)性光膠為例，曝光的部分發(fā)生聚合反應(yīng)而得以保留，未曝光的部分被顯影液溶解洗去，留下的圖形就作為芯片復(fù)制的陽模。然后，將PDMS預(yù)聚體傾倒在陽模上，進(jìn)行烘烤使得PDMS預(yù)聚體交聯(lián)固化形成澆鑄的圖形，從圖形的四周切下PDMS芯片并從陽模上剝離起來，此時芯片管道已經(jīng)在PDMS上形成凹槽。最后，在適當(dāng)?shù)牡胤酱蚩仔纬扇芤旱倪M(jìn)出口，將帶有圖形的PDMS基片與另一片平面結(jié)合，進(jìn)行可逆或者不可逆的封接，完成芯片的制作。

圖1 軟蝕刻技術(shù)和多層軟刻蝕技術(shù)制作微流控芯片[5-6](A)軟刻蝕技術(shù)原理示意圖；(B)多層軟刻蝕技術(shù)原理示意圖，并列的微閥形成主動式微泵示意圖及實(shí)物照片。

軟蝕刻技術(shù)誕生后，人們開始可以利用PDMS彈性材料大量制作微流控芯片，同時也開始尋找各種可能的方法，以便能夠在芯片上集成微閥和微泵等能夠操控液體的控制元件。2000年，加州理工學(xué)院的Quake等人發(fā)明了多層軟蝕刻技術(shù)，使得大規(guī)模集成微閥和微泵成為可能[6]。該技術(shù)巧妙地利用了PDMS材料的彈性，在芯片中可以方便地制作能夠快速開關(guān)的氣動微閥。2002年,他們又在美國《科學(xué)》雜志上報(bào)道集成了上千個微閥和上百個微反應(yīng)腔室的微流控芯片，真正實(shí)現(xiàn)了芯片從簡單控制到高密度大規(guī)模集成的飛躍。多層軟蝕刻技術(shù)制作微閥微泵的過程如圖1B所示。基于軟蝕刻PDMS芯片復(fù)制技術(shù)，將兩次制作的PDMS芯片管道上下交疊，中間以極薄的PDMS薄膜隔開分別作為流體層和控制層，當(dāng)向控制層的管道施加氣壓的時候，PDMS薄膜會受擠壓形變從而關(guān)閉流體層的管道，這樣就形成了芯片中的主動微閥。這種主動閥的響應(yīng)時間為毫秒量級，可以快速地在開與關(guān)兩種狀態(tài)之間切換。將3個主動閥并列排列，交叉相應(yīng)，就形成了微型蠕動泵，可以有效地在芯片中傳輸液體。這種通過多層軟蝕刻技術(shù)制備的主動閥有體積小、密封性好、透光性好、反應(yīng)快、可精確驅(qū)動、高度集成化、使用時間長、制作簡單、成本低等優(yōu)勢，因而被廣泛使用到高通量的集成微流控芯片中。

2 微流控芯片的應(yīng)用

2.1 微流控芯片用于生物大分子的分析

在某種程度上說,早期的微流控芯片是一種集成化的微分離器件。微分離已經(jīng)成為微流控芯片領(lǐng)域中最成熟的一類技術(shù)，它在工業(yè)和商業(yè)上的率先成功應(yīng)用有力地推動了微流控芯片的發(fā)展和壯大。在芯片上進(jìn)行電泳的研究仍然是微流控領(lǐng)域的主流之一，微流控芯片的最早一輪應(yīng)用也大都是從芯片毛細(xì)管電泳開始的。分離，特別是電泳分離，無疑在微流控芯片的研究中占有極為特殊的地位。需要強(qiáng)調(diào)的是，微流控芯片所涉及的分離只是芯片眾多功能操作單元中的一種，而不是全部，盡管很多時候它還會被單獨(dú)使用。

圖2 用于高通量DNA測序的集成CD微流控芯片[8]蜿蜒管道能有效增加通道長度

DNA測序是核酸分析的最根本的手段，基于Sanger末端中止法的陣列毛細(xì)管電泳更是第一代DNA測序儀所采用的主流技術(shù)。隨著微流控芯片技術(shù)的開端,最先用于其上的分析手段就是毛細(xì)管電泳，而如何利用芯片能夠大規(guī)模集成的特點(diǎn)進(jìn)行高通量快速的測序成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)問題。加州大學(xué)伯克利分校的Mathies等人設(shè)計(jì)了一種96通道微陣列電泳微流控芯片，使高通量的DNA測序第一次得以在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)[8]。該芯片采用了轉(zhuǎn)角蜿蜒設(shè)計(jì)(圖2)，將有效分離管道的長度加長到16cm，從而增加了一次電泳分析的可讀片斷長度，極大地提高了分析的通量。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的基礎(chǔ)，如何得到所需蛋白的單質(zhì)結(jié)晶是確定整個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一個主要瓶頸。微流控芯片上管道和流路精確可控、高度集成，從而為蛋白質(zhì)結(jié)晶過程中的條件優(yōu)化提供了一種新型平臺，而且由于芯片中的液體體積多在納升級別，可以極大節(jié)省辛苦提純得到的蛋白質(zhì)樣品。芝加哥大學(xué)的Ismagilov研究組提出了一種芯片中高效簡單的蛋白質(zhì)單晶條件篩選新方法。他們在“T”字形管道芯片中的“T”節(jié)點(diǎn)處控制產(chǎn)生微液滴，從而形成一個個單獨(dú)分散的微反應(yīng)器，并在下游直接由X射線衍射出微液滴中蛋白單晶的衍射圖，從而最終確定蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)。通過控制各個分支管道中的流量，可以精確地控制蛋白和共沉淀劑的比例，此外單晶的結(jié)構(gòu)可以直接在下游讀出[9]。而Quake小組則通過高度集成的“配方芯片”和通過微尺度下自由擴(kuò)散的方式，在芯片上實(shí)現(xiàn)了對結(jié)晶條件的快速篩選、對結(jié)晶過程的細(xì)微控制和晶體衍射數(shù)據(jù)的采集，極大提高了工作效率[10]。

2.2 微流控芯片用于細(xì)胞生物學(xué)的研究

細(xì)胞是生命的基本組成單元，細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展是推動現(xiàn)代生命科學(xué)進(jìn)步的重要動力。我們對生命過程的深入了解和對人類健康的研究都離不開高效準(zhǔn)確的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。隨著細(xì)胞生物學(xué)不斷發(fā)展，我們對細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、組成和功能有了越來越多的了解，絕大多數(shù)認(rèn)識是建立在針對大量細(xì)胞的系綜平均結(jié)果基礎(chǔ)上的。然而,近年來的一些深入研究表明，許多生命現(xiàn)象無法簡單地從系綜平均上得以理解和闡明，故在少量細(xì)胞乃至單個細(xì)胞層次上進(jìn)行生命科學(xué)的研究顯現(xiàn)出了迫切的重要性。絕大多數(shù)細(xì)胞的大小位于微米尺度，正好同微流控芯片中的通道大小相適應(yīng)，這一匹配為操縱少數(shù)或者單個細(xì)胞提供了極為便捷的條件。集成微流控芯片在操作上可控性很強(qiáng)，從而為進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、原位觀察以及實(shí)時動態(tài)的微環(huán)境調(diào)控提供了可能性，在小體積內(nèi)進(jìn)行這樣的實(shí)驗(yàn)還有助于保持合適的濃度、較短的傳質(zhì)時間、較快的時間響應(yīng)和長時間的動態(tài)追蹤。

微流控芯片發(fā)展的一個重要方面就是要從生物學(xué)家的角度制造和發(fā)明為他們所樂于接受和易于使用的芯片裝置。威斯康辛大學(xué)的Beebe研究組發(fā)明了一種細(xì)胞培養(yǎng)芯片，其結(jié)構(gòu)很簡單而想法卻很巧妙。他們利用微通道兩端開口處的表面張力差作為驅(qū)動力產(chǎn)生持續(xù)的流動，控制細(xì)胞和相應(yīng)的溶液(圖 3A)，還可以利用芯片管道中的層流效應(yīng)來處理管道中的部分細(xì)胞[11]。該芯片可以與移液器一起配合進(jìn)行高通量的細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)，更易于被生物學(xué)家接受和采用。

Quake等人則將微生物培養(yǎng)恒化器集成在微流控芯片上，對大腸桿菌的恒化培養(yǎng)中所需的關(guān)鍵步驟，如洗滌、注入、恒化培養(yǎng)、循環(huán)泵流等，都能夠?qū)崿F(xiàn)自動化(圖 3B)。在應(yīng)用該裝置研究大腸桿菌的基因反饋回路的恒化培養(yǎng)時，他們發(fā)現(xiàn)該裝置能夠維持幾百個大腸桿菌的恒化培養(yǎng)長達(dá)幾天;而通常情況下,在大體積的體系中的反應(yīng)都會由于桿菌數(shù)量較多而增加了基因變異的概率，從而使得菌落很快失去基因的自反饋調(diào)節(jié)。相對于傳統(tǒng)方法，該芯片裝置更適合長期進(jìn)行的細(xì)菌恒化培養(yǎng)研究，而且具有單細(xì)胞水平的分辨率[12]。

圖3 表面張力驅(qū)動的高通量細(xì)胞培養(yǎng)微流控芯片和用于微生物恒化培養(yǎng)的微流控生物反應(yīng)控制體系[11-12] (A) 表面張力驅(qū)動液流示意圖，192通道陣列細(xì)胞培養(yǎng)芯片照片以及其中一個管道在連續(xù)培養(yǎng)3T3-L1細(xì)胞5天之后照片；(B) 微生物微流控芯片恒化培養(yǎng)反應(yīng)裝置，芯片實(shí)物圖和芯片結(jié)構(gòu)照片。

細(xì)胞內(nèi)組分復(fù)雜，胞內(nèi)特定組分或內(nèi)涵物的分析測定對研究細(xì)胞代謝過程、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞功能具有重要意義。微流控芯片有可能將各種細(xì)胞操作技術(shù)與電泳過程集成為一體，是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)(特別是單個細(xì)胞內(nèi))組分分析的重要技術(shù)平臺;特別是在其中還可以結(jié)合多層芯片的集成技術(shù)加工微泵、微閥、微腔室進(jìn)行單細(xì)胞的操作和分析。斯坦福大學(xué)的Zare研究組設(shè)計(jì)制作了一種多功能集成的單細(xì)胞分析芯片，實(shí)現(xiàn)了對單個T淋巴瘤細(xì)胞內(nèi)氨基酸的測定[13]。該芯片將單個細(xì)胞的操縱、化學(xué)試劑定量運(yùn)輸、細(xì)胞裂解、胞內(nèi)氨基酸熒光標(biāo)記和電泳分離等功能單元集成在一塊芯片上，并通過調(diào)節(jié)控制“全開”、“半開”和“全關(guān)”功能的三相閥來控制液體的運(yùn)輸，整個反應(yīng)池體積很小(約70pL)，試劑消耗大大減少，單細(xì)胞內(nèi)涵物的稀釋被大大地降低。結(jié)果顯示，單細(xì)胞內(nèi)氨基酸電泳分離效果較好，并與群體細(xì)胞的胞內(nèi)氨基酸電泳結(jié)果做了比較。該課題組在隨后的研究中進(jìn)一步發(fā)展了這種方法(圖4A)，在芯片中全集成了單細(xì)胞的分離、操作、細(xì)胞裂解、熒光標(biāo)記等功能單元，在管道下游用聚焦成線狀的激光來激發(fā)單個分子的熒光并通過高靈敏度的CCD進(jìn)行收集，計(jì)數(shù)并分析了單個細(xì)胞內(nèi)極低拷貝數(shù)的蛋白質(zhì)β2AR。該方法可以對單個細(xì)胞中少于1000個的蛋白質(zhì)分子進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時通過校正消除PDMS材料自發(fā)熒光的影響[14]，這一方法對單個細(xì)胞的研究提供了一個很可行的思路。

圖4 用于單細(xì)胞中低豐度蛋白計(jì)數(shù)的微流控芯片裝置和單細(xì)胞中隨機(jī)蛋白表達(dá)的單分子熒光分析芯片[14-15](A) 用于單細(xì)胞操縱與低拷貝蛋白計(jì)數(shù)的微流控芯片(左側(cè))以及分子技術(shù)微管道(居中)，物鏡聚焦的激發(fā)光位置示意圖和CCD分子熒光成像的照片(右側(cè))；(B) 用于研究單細(xì)胞中蛋白隨機(jī)表達(dá)的芯片結(jié)構(gòu)示意圖(左圖)，酵母細(xì)胞被固定限制在芯片的微管道中，封閉微管道中的熒光素濃度隨時間變化曲線。

細(xì)胞是極為復(fù)雜的體系，在細(xì)胞中的隨機(jī)生物學(xué)事件，如隨機(jī)的蛋白表達(dá)，往往在特定的時刻決定細(xì)胞功能甚至細(xì)胞的命運(yùn)。傳統(tǒng)的生物學(xué)方法缺乏很好的手段來研究細(xì)胞中的隨機(jī)過程。哈佛大學(xué)的謝曉亮研究組利用微流控芯片技術(shù)結(jié)合β-半乳糖苷酶基因作為報(bào)告基因，應(yīng)用單分子熒光技術(shù)將單個酵母和大腸桿菌細(xì)胞封閉在微流控芯片的微培養(yǎng)腔室中,研究了單個細(xì)胞中蛋白表達(dá)的隨機(jī)性(圖 4B)。芯片封閉了單個細(xì)菌細(xì)胞的微環(huán)境，既可使β-半乳糖苷酶催化生成的熒光產(chǎn)物迅速地被泵到細(xì)胞外，也可以很快在微腔室中積累到足以被檢測的濃度[15]。因此芯片上的實(shí)驗(yàn)從技術(shù)上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的不足，使人們可以更容易在單分子水平上觀察到原先傳統(tǒng)方法難以觀察的生物學(xué)現(xiàn)象和事件。

要從根本上研究細(xì)胞生物學(xué)，最直接的方法就是對單細(xì)胞的基因進(jìn)行測序和分析，甚至是在給定的環(huán)境、給定的時間點(diǎn)進(jìn)行全基因組的分析，這就要求對單細(xì)胞的mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后PCR擴(kuò)增將低豐度的基因信號放大。Quake研究組應(yīng)用他們發(fā)展的多層芯片制作技術(shù)為這一目標(biāo)提供了一種基本的方法，他們通過大規(guī)模集成微閥、微泵和微腔室，在PDMS芯片中全集成了從單細(xì)胞分選到mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并分析了基因表型[16]。

2.3 微流控芯片用于生物醫(yī)學(xué)診斷的研究

隨著微流控芯片技術(shù)的日臻成熟，人們希望微流控芯片能夠走出實(shí)驗(yàn)室，真正進(jìn)入到應(yīng)用領(lǐng)域并對人們的日常生活產(chǎn)生真正的影響，生物醫(yī)學(xué)診斷無疑是微流控芯片最為適合也是最具有潛力的應(yīng)用領(lǐng)域。

圖5 芯片中快速合成放射性診斷輔助藥物[18F]FDG[17](A) 合成路線圖及芯片結(jié)構(gòu)示意圖；(B) 芯片實(shí)物圖；(C) 芯片中快速制備的[18F]FDG純度分析；(D) 芯片中快速制備的[18F]FDG注射小鼠后的PET成像結(jié)果。

經(jīng)典的化學(xué)合成通常在燒瓶、燒杯等較大體積容器中進(jìn)行，而有些反應(yīng)產(chǎn)物由于其自身壽命的限制，需要人們更快地合成制備所需的產(chǎn)物，比如在臨床診斷特別是癌癥診斷和治療監(jiān)測中重要的醫(yī)學(xué)成像技術(shù)正電子發(fā)射斷層掃描(positron emission tomography，PET)診斷中，重要的放射性顯像藥物18氟-2-脫氧葡萄糖(2-deoxy-2-[18F]fluoro-D-glucose，[18F]FDG)的常規(guī)合成需要訓(xùn)練有素的工作人員使用特有的設(shè)備并花費(fèi)幾十分鐘的工作時間。但是該化合物的半衰期卻只有110分鐘，這在很大程度上限制了這一技術(shù)的臨床應(yīng)用。美國加州理工學(xué)院和加州大學(xué)洛杉磯分校的科學(xué)家利用在微流控芯片中集成大量微閥、微泵，將[18F]FDG合成中的氟化物富集、脫水、標(biāo)記、脫乙腈、水解5步反應(yīng)高度集成在微流控芯片上(圖5)，使該化合物的合成全過程縮短至僅僅14分鐘，并將芯片上合成產(chǎn)物直接注射入小鼠體內(nèi)，利用PET得到腫瘤分布的清晰圖像[17]。

弗吉尼亞大學(xué)的Landers課題組發(fā)明了一種能夠直接接受全血作為分析樣品的集成微流控芯片,該芯片集成了樣品前處理(從全血中實(shí)現(xiàn)核酸的固相萃取)、PCR擴(kuò)增和核酸電泳分析3個功能區(qū)域，各個區(qū)域之間以微閥分隔開來，最大程度地避免了上游操作對下游分析的污染。為了展示這種“樣品進(jìn)-結(jié)果出”(sample-in-answer-out)的全集成式微流控芯片的分析能力，作者檢測了750nL被炭疽病毒感染的小鼠全血中的炭疽病毒DNA，并且僅用1μL鼻腔提取液確診了一名患者體中的百日咳病毒，全部分析過程只用了不到30分鐘[18]。

美國哈佛醫(yī)學(xué)院的Toner課題組最近在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)了從未經(jīng)任何處理的全血中分離出循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell)[19]。該芯片采用硅作為基片，加工出了密集的微立柱，用表面化學(xué)的方法在硅基片上修飾了腫瘤細(xì)胞抗體EpCAM，當(dāng)全血流經(jīng)芯片時，由于細(xì)胞與基底的結(jié)合力，循環(huán)腫瘤細(xì)胞被從全血中分離出來以便進(jìn)一步檢測。他們用該芯片成功地從117例患有前列腺癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌的患者的全血中分離檢測到了116例樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，檢出率達(dá)到99%。

圖6 微流控芯片裝置用于活力精子細(xì)胞的分選[20](A) 實(shí)驗(yàn)顯微觀察圖，活力精子穿過原有流層；(B) 實(shí)驗(yàn)原理示意圖。

密西根大學(xué)的Takayama實(shí)驗(yàn)室提出了一種在微流控芯片上簡單分離有活力的精子的方法(圖6)[20]。該方法利用微通道中流體所特有的層流的性質(zhì)，在Y形分叉的一個分支中加入精子樣品，在另一個分支中添加緩沖溶液。由于層流作用的存在，這兩股流體在通過合并管道后，除了少量擴(kuò)散外不會有其他因素促進(jìn)混合，因此絕大多數(shù)沒有活力的精子細(xì)胞會平直地流出，而有活力的精子由于自身的游動會從原有的流層中游出，“主動擴(kuò)散”到相鄰的緩沖液層。該芯片構(gòu)造極為簡單，無須外界注射泵等外源能量的介入，利用表面張力和重力將待測樣品從入口一端泵到出口，而有活力的精子在側(cè)邊的一個出口得以有效地富集。

3 結(jié)論

微流控芯片技術(shù)作為一種新興的技術(shù)手段，盡管只經(jīng)歷了短短20年的發(fā)展，已經(jīng)從最初單純的毛細(xì)管電泳的微型化技術(shù)演變成為一種涵蓋了從基礎(chǔ)生物技術(shù)到生物醫(yī)學(xué)診斷等各個領(lǐng)域的富有活力的工具性方法平臺。隨著微流芯片技術(shù)和科技的不斷發(fā)展，相信在不久的將來，微流控芯片技術(shù)與其他的代表性技術(shù)會在更為廣泛的研究領(lǐng)域中交叉滲透，快速發(fā)展，而且也會更加直接地深入到人們的日常生活甚至平常使用的器件當(dāng)中，真正實(shí)現(xiàn)“μ-fluidic inside”。當(dāng)前微流控芯片技術(shù)的發(fā)展處于理性的發(fā)展階段，既沒有了20世紀(jì)90年代領(lǐng)域興起時的過度樂觀，也徹底擺脫了10年前這一領(lǐng)域發(fā)展的低谷期。從近年來微流控技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用實(shí)例上可以推測，這一技術(shù)今后的發(fā)展將集中在大規(guī)模、高通量、低消耗的生命科學(xué)和分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，包括單細(xì)胞培養(yǎng)與分析、干細(xì)胞操控與培養(yǎng)、單分子生物物理學(xué)、高通量的細(xì)胞與分子生物學(xué)篩選實(shí)驗(yàn)、藥物發(fā)現(xiàn)、高通量合成生物學(xué)、高通量測序技術(shù)、單細(xì)胞基因組學(xué)等領(lǐng)域都將大大受惠于微流控的實(shí)驗(yàn)平臺。在今后的發(fā)展中，微流控技術(shù)不可避免地會持續(xù)面臨一些挑戰(zhàn)和受到芯片形式局限性的制約，特別是如何在保證實(shí)驗(yàn)可靠性和平行性的前提下提高芯片操控的簡便性、解決芯片與外界連接的損耗過大問題、在簡化芯片復(fù)雜度的同時提高實(shí)驗(yàn)通量、實(shí)現(xiàn)芯片上成熟分析化學(xué)手段的高效移植、發(fā)展更加有效的芯片觀察手段等方面的進(jìn)步與突破，將成為推動微流控技術(shù)應(yīng)用進(jìn)一步發(fā)展的重要動力。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Whitesides G M.Nature,2006,442:368

[2] Terry S C.A Gas Chromatographic Air Analyser Fabricated on Silicon Wafer Using Integrated Circuit Technology.Doctor Dissertation,Stanford University,1975

[3] Manz A,Graber N,Widmer H M.SensorActuatB-Chem,1990,1:244

[4] Harrison D J,Fluri K,Seiler K,etal.Science,1993,261:895

[5] Duffy D C,McDonald J C,Schueller O J A,etal.AnalChem,1998,70:4974

[6] Unger M A,Chou H P,Thorsen T,etal.Science,2000,288:113

[7] Thorsen T,Maerkl S J,Quake S R.Science,2002,298:580

[8] Paegel B M,Emrich C A,Weyemayer G J,etal.PNatlAcadSciUSA,2002,99:574

[9] Zheng B,Tice J D,Roach L S,etal.AngewChemIntEd,2004,43:2508

[10] Hansen C L,Sommer M O A,Quake S R.PNatlAcadSciUSA,2004,101:14431

[11] Meyvantsson I,Warrick J W,Hayes S,etal.LabChip,2008,8:717

[12] Balagadde F K,You L C,Hansen C L,etal.Science,2005,309:137

[13] Wu H K,Wheeler A,Zare R N.PNatlAcadSciUSA,2004,101:12809

[14] Huang B,Wu H K,Bhaya D,etal.Science,2007,315:81

[15] Cai L,Friedman N,Xie X S.Nature,2006,440:358

[16] Marcus J S,Anderson W F,Quake S R.AnalChem,2006,78:3084

[17] Lee C C,Sui G D,Elizarov A,etal.Science,2005,310:1793

[18] Easley C J,Karlinsey J M,Bienvenue J M,etal.PNatlAcadSciUSA,2006,103:19272

[19] Nagrath S,Sequist L V,Maheswaran S,etal.Nature,2007,450:1235

[20] Cho B S,Schuster T G,Zhu X Y,etal.AnalChem,2003,75:1671