魔芋精粉中葡甘露聚糖含量的測定
——開放性化學實驗探索

徐瑜 徐偉明 周晶

(杭州師范大學材料與化學化工學院 浙江杭州 310036)

開放性實驗[1-2]可以使實驗室教學資源得到充分利用，學生可以運用所學的化學知識，結合實際，自己設計課題，采用合作學習的方式解決問題。開放性實驗能使學生得到自主探索研究的機會，對于提高學生綜合素質、培養創新意識和實踐能力很有意義。

我們選擇了一個有教學意義、難度適宜的課題——魔芋精粉中葡甘露聚糖含量的測定，作為開放性化學實驗，對我?；瘜W類專業學生開設。該實驗涉及有機化學、高分子化學、分析化學、儀器分析等課程知識以及實驗操作的綜合應用。

1 課題背景知識介紹

魔芋是一種草本植物，是我國的特產，廣泛分布于長江流域。魔芋球莖中含有葡甘露聚糖(KGM)、淀粉、生物堿、纖維素和礦物質等營養成分，其中KGM是一種優良的低熱量、低脂肪、高纖維素的水溶性膳食纖維。許多研究表明，KGM具有降血糖、降血脂及逆轉脂肪肝、通便減肥、抗癌、增強免疫功能、抗衰老等[3]保健作用和醫療功效。魔芋葡甘露聚糖有獨特的理化性質和一些優良的特性，如強吸水性、可食用性、流變性、增稠性、凝膠性和成膜性，在制藥工業、日用化學工業、造紙工業等領域有廣泛的應用。

魔芋葡甘露聚糖是已知植物膠中黏度最大的天然高分子多糖，其分子式為(C6H10O6)n。對KGM化學結構研究的有關報道很多，但其確切結構至今尚無定論，奧山典生等人推測它的結構如圖1所示。

圖1 KGM的推測結構

2 實驗方案設計

有多種用于評價魔芋精粉和相應產品質量的方法；KGM含量是評價的關鍵指標。KGM含量的測定方法有很多種，有費林滴定法、3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)、甘露糖膠重量法、苯酚比色法、旋轉黏度法、薄層色譜法、氣相色譜法[4]和高效液相色譜法，每種方法都有各自的優缺點。根據這一情況，可讓學生查找相關文獻，根據自己的知識水平和興趣，選擇一種或幾種測定方法進行實驗，并對實驗結果進行分析和比較；然后采用小組討論的形式探討是否可行；再由教師把關，逐一進行評價；最后制定出最佳實驗方案。這一過程有助于開闊學生的思維，培養學生比較辨別的能力。高年級的學生還可對所用測定方法中不同因素對實驗結果的作用和影響進行分析和評價。

2.1 實驗前準備工作

學生選擇某種測定方法后，根據文獻準備實驗用化學藥品、試劑和儀器，其中遇到如氣相色譜儀、液相色譜儀、紫外可見分光光度計等大型儀器時，還需進一步學習和鞏固這些儀器的實驗原理和操作方法。

2.2 樣品的預處理

樣品的預處理即KGM的提取方法有好幾種：酸性冷溶法、酶解法、沸水溶解法、乙醇沉淀法、超聲波提取法、甲酸-氫氧化鈉緩沖液溶脹法等。每種提取方法都有自己的優缺點，學生可以根據實驗室條件和實驗時間選擇感興趣的方法。

2.3 實驗操作

選擇好樣品測定方法和預處理方式后進行實驗操作。

2.3.1 3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)[5-6]

選擇甲酸-氫氧化鈉緩沖液溶脹法提取KGM，制作標準葡萄糖工作液的曲線，確定最大吸收波長，制備KGM水解液，選擇一定的顯色時間、DNS添加量、水解酸度和水解時間等因素進行檢測，按下式算出KGM的含量：

式中w(KGM)為KGM的質量分數(下同);ε為甘露糖和葡萄糖在葡甘露聚糖分子中的殘基分子量與葡甘露聚糖水解后得到的甘露糖和葡萄糖相對分子質量之比；T樣為水解液的吸光度值；T白為空白樣的吸光度值；m為魔芋粉樣品質量。

2.3.2 高效液相色譜法[7]

選擇超聲波提取法來提取KGM，制作含葡萄糖、甘露糖均為0.1mmol/L標準混合液的工作曲線，制備KGM水解液，按標準曲線法進行操作，衍生化后采用反相高效液相色譜法，分段梯度洗脫，檢測波長為250nm，按下式計算KGM含量：

式中mM為樣品中甘露糖質量；mG為樣品中葡萄糖質量；m為樣品魔芋精粉的質量。

2.3.3 甘露糖腙重量法[8]

選擇酸性水解法提取KGM，冷卻后過濾，收集濾液，調節pH至3.0，加苯肼混合，室溫條件下靜置18～20h，用已干燥至恒重(m1)的定量濾紙過濾，洗滌沉淀及濾紙，將帶有沉淀的濾紙烘干至恒重(m2)，按下式計算KGM含量：

式中m為樣品質量；m1為干燥濾紙質量；m2為干燥沉淀和濾紙的總質量；1.0351為由甘露糖到葡甘聚糖的換算系數。

2.3.4 苯酚比色法[9]

選擇乙醇沉淀法提取KGM，繪制標準葡萄糖工作液的曲線，配制KGM樣品液，加入6.0%苯酚試劑，于冰水浴中加適量濃硫酸，冷卻后于490.0nm波長處測吸光度，按下式計算KGM含量：

式中ε為多糖的校正系數；ρ1為標準曲線上查得的樣品質量濃度；ρ2為加入樣品的質量濃度。

2.4 結果分析

通過上述實驗操作，學生可以感受到整個科學研究的過程，對不同的測定方法得到的結果進行分析和比較，總結出最佳的實驗條件；還可進一步進行放大試驗、精密度試驗、重現性試驗、回收率試驗等，分析誤差產生的原因和操作的關鍵，總結經驗。

2.4.1 DNS比色法

DNS比色法的測定原理是：魔芋葡甘露聚糖水解后生成甘露糖和葡萄糖兩種還原糖，3,5-二硝基水楊酸與還原糖共熱后生成棕色的氨基化合物，在一定范圍內，還原糖的量同反應液的顏色強度呈比例關系，利用比色法可測定魔芋中葡甘露聚糖的含量。

在KGM的提取方法上要說明以下幾點：1) 常規水提法的不足之處是魔芋粉水溶脹后，溶液較渾濁，顆粒多且破碎不完全，導致KGM不能完全溶出，KGM含量測定值偏低，提取時間長；2) 超聲波提取法利用超聲波具有的機械振動能、熱學性能和強大的空化效應，用超聲波清洗器在除去魔芋精粉中的游離還原糖后，超聲提取魔芋精粉中的KGM并進行檢測，與常規水提法相比，該方法提取時間縮短，提取效率提高；3) 甲酸-氫氧化鈉緩沖液溶脹法提取效率高，簡單快速，結果可靠，省去了常規法、超聲水提法中用85%乙醇除去游離還原糖的操作，通過試樣空白對照扣除，以獨特的定容方法避免了轉移過程中容器壁上附著KMG，從而使結果更加準確，實驗重現性高。

DNS比色法不需昂貴的大型分析儀器，操作簡便，容易上手，但此法中氨基化合物的吸光度隨時間的變化而變化，必須使葡萄糖標準溶液的顯色反應后存放時間與樣品溶液的顯色反應后存放時間一致，以減少因顯色反應后存放時間不同而造成的分析誤差；另外此法不能得出KGM分子中甘露糖和葡萄糖的物質的量比。

2.4.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法首先測定標準混合液中甘露糖和葡萄糖這兩種單糖間的校正因子，把樣品中甘露糖和葡萄糖的峰面積與內標物鼠李糖峰面積的比值分別代入各自的線性回歸方程，求得各自的量，再經計算得樣品的KGM含量與兩種單糖的比例。

該方法分離效率高，分析快速，定量準確，檢測時間較短，準確度較高，能同時測定KGM含量及其單糖組成。但儀器昂貴，所需試劑比其他方法偏貴，實驗操作較復雜。

2.4.3 甘露糖腙重量法

甘露糖腙重量法的原理是甘露糖與苯肼反應，生成甘露糖腙，而葡萄糖對甘露糖與苯肼反應沒有影響，甘露糖在葡甘露聚糖中以一定比例存在，只要葡甘露聚糖徹底水解，就可以準確測出甘露糖的含量，通過換算能夠得到KGM的含量。

此法不受淀粉、纖維素及其他可溶性糖的影響，沒有溶脹及分離雜質的麻煩，但分析過程中被分析組分易損失，誤差大。

2.4.4 苯酚比色法

苯酚比色法的測定原理是：先用50%乙醇浸泡，離心，除去單糖、雙糖、低聚糖、苷類、生物堿等干擾成分，然后用水提取其中所含的可溶性多糖，多糖類成分在濃硫酸作用下，水解生成單糖，再與苯酚縮合生成黃色化合物，顏色深淺與糖的濃度成正比，從而可求得KGM含量。此法與DNS比色法類似。

該方法測定KGM含量簡單快速，穩定性好，易操作，原料簡單價廉，但操作要仔細，否則令結果偏低，標準液和樣品液的濃度需合理配制，吸光度需控制在一定范圍內。

2.4.5 開放性實驗的實踐與分析

我們發現最初學生得到這個課題后根本不知道該從哪里下手，只是像平時一樣，期待教師把具體的實驗方案、實驗步驟明明白白地寫下來再進行實驗。經過指導教師講解如何進行文獻檢索及如何確定實驗方案的演示，學生能逐漸進入到研究狀態，自己尋找感興趣的實驗方法并進行實驗，在此過程中發現不理解的和有疑問的地方能主動探討，學生的積極性和熱情較高。

在這個開放性實驗過程中，我們發現學生最容易掌握甘露糖腙重量法，但初期實驗結果誤差較大；對于DNS比色法和苯酚比色法，學生掌握的難易情況次之，主要是對試劑的預處理不夠好，數據處理和計算公式的推導不熟練；較難掌握的一種方法是高效液相色譜法，由于涉及到大型儀器高效液相色譜儀，對實驗原理的理解和實驗操作都有一定的困難。學生采用這些方法進行實驗的重點是要先準確掌握各種實驗方法的測定原理，這樣在后面的實驗操作中才能做到胸有成竹。

通過開放性實驗，學生不僅系統查閱文獻的能力得到顯著提高，而且通過對實驗的多次重復，從實驗原理分析誤差的來源，實驗動手能力也大有提高；另外，在實驗過程中，通過學習超聲波清洗器、紫外可見分光光度計、高效液相色譜儀等大型儀器的使用，培養了學生綜合運用多門化學課程的相關知識的能力；最后，同學之間還可以通過對實驗結果和影響因素的分析、比較，在學會體會實驗方法的多樣性帶來樂趣的同時，掌握科學研究的嚴謹性。

3 結語

在實驗過程中，可能會出現各種意外情況，教師要及時作必要的指導和調整。開放性實驗突出了學生的主體地位，這種模式對提高學生的創新能力和綜合能力是非常重要的。

參 考 文 獻

[1] 李文杰.重慶工學院學報,2006,20(6):157

[2] 王潤孝,李小聰.中國高等教育,2005,9:37

[3] 古元冬,史建勛,胡卓逸.中草藥,1999,30(2):127

[4] 廖燕芝,楊代民,張繼紅,等.食品與生物技術學報,2008,27(4):66

[5] 張秋云.中國民族民間醫藥,2008,5:69

[6] 喻玲玲,鄒坤.時珍國醫國藥,2008,19(3):680

[7] 袁忠海,吳道澄,趙燕,等.中國中藥雜志,2003,28(7):621

[8] 王中鳳,張盛林,劉佩瑛,等.食品與發酵工業,2001,27(10):53

[9] 易春艷,李佳鳳,余愛農,等.食品工業科技,2006,27(4):177