阿魏酸酯酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

鄧軼韜,李夏蘭,陳宗香,蔡婀娜

(華僑大學(xué)化工學(xué)院,福建泉州 362021)

阿魏酸酯酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

鄧軼韜,李夏蘭,陳宗香,蔡婀娜

(華僑大學(xué)化工學(xué)院,福建泉州 362021)

從土壤中篩選到1株阿魏酸酯酶活力較高的菌株,通過形態(tài)觀察,初步鑒定其為曲霉.通過單因素輪換法,對其液態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果表明:在查氏培養(yǎng)基中,以質(zhì)量體積比為6%的麥麩為碳源,質(zhì)量體積比為5%的硝酸鈉為氮源,在30℃下發(fā)酵培養(yǎng)6 d后,其酶活力最高可達(dá)16.33μkat·L-1.

阿魏酸;阿魏酸酯酶;曲霉;篩選

阿魏酸酯酶(Feruloyl Esterases,FA Es)是羧酸酯酶的一個亞類,能水解植物細(xì)胞壁中羥基肉桂酸與糖之間的酯鍵[1],可應(yīng)用于從農(nóng)副產(chǎn)品中釋放阿魏酸[2],漂白紙漿[3],生產(chǎn)燃料乙醇[4],以及生物合成酚酸衍生物[5].自1991年 Faulds等[6]首次分離出阿魏酸酯酶以來,已有超過30種阿魏酸酯酶被純化[7].國內(nèi)對阿魏酸酯酶的研究主要集中于黑曲霉.歐仕益等[8]開展了黑曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶和阿拉伯木聚糖酶的研究;王洪川等[9]利用黑曲霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸酯酶,其酶活可達(dá)7.421 nkat·g-1;張帥兵等[10]完成了黑曲霉阿魏酸酯酶A的克隆和表達(dá);謝春元等[11]研究了阿魏酸酯酶在飼料瘤胃降解中的功效,發(fā)現(xiàn)阿魏酸酯酶既能加快飼料的降解速率,又能提高降解程度.本文通過初篩和復(fù)篩從土壤中獲得1株阿魏酸酯酶產(chǎn)生菌,并優(yōu)化其液態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)酶條件.

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件

(1)菌種保藏培養(yǎng)基(馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基).取200 g馬鈴薯切成小塊,加水煮沸0.5 h,過濾,取濾液,加入20 g葡萄糖,15 g瓊脂,補(bǔ)足水至1 L,p H值自然;然后,倒入試管中,于121℃滅菌20 m in后制成斜面.菌種接種到培養(yǎng)基后于30℃培養(yǎng)數(shù)天,待菌落成熟后轉(zhuǎn)到4℃保存.

(2)菌種分離培養(yǎng)基.將滅過菌的馬鈴薯培養(yǎng)基倒入無菌平皿中室溫冷卻凝固;將菌液涂布于培養(yǎng)基上,于30℃培養(yǎng)至成熟.

(3)初篩培養(yǎng)基.FeSO4·7H2O 0.01 g,NaNO32.0 g,KCl 0.5 g,M gSO4·7H2O 0.5 g,K2HPO41.0 g,蔗糖30 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L,p H值自然;121℃滅菌20 min.每塊平板倒入約20 m L培養(yǎng)基后,立即加入0.3 m L無菌的含阿魏酸乙酯的二甲基甲酰胺溶液(質(zhì)量體積比為10%),搖勻至平板呈均勻的乳白色.接種后于30℃培養(yǎng)數(shù)天,觀察是否有透明圈出現(xiàn).

(4)種子培養(yǎng)基(馬鈴薯培養(yǎng)基,不含瓊脂).在250 mL搖瓶中加入50 mL培養(yǎng)基,于121℃滅菌20 min.取一環(huán)保存于4℃馬鈴薯斜面上的菌種接種到50 m L馬鈴薯搖瓶培養(yǎng)基中,于30℃,200 r· min-1下培養(yǎng)24 h.

(5)復(fù)篩培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基).FeSO4·7H2O 0.01 g,NaNO32.0 g,KCl 0.5 g,K2HPO40.76 g, M gSO4·7H2O 0.5 g,麥麩20 g,蒸餾水1 L,p H值自然.在250 mL搖瓶中稱取1 g麥麩,再加入50 mL液體部分,于121℃滅菌20 min.將培養(yǎng)24 h的種子液按體積比為4%的接種量接種到50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,于30℃,200 r·min-1下培養(yǎng)一定時間.

1.2 菌種篩選與鑒定

土樣分別取自福建泉州華僑大學(xué)附近的菜地和果園.將一定量的土樣置于無菌平皿中,再以體積比為1∶1.5的比例加入麥糟(50目),攪拌均勻后用無菌水潤濕,于30℃培養(yǎng)3 d.稱取1 g土樣放入盛有99 m L無菌水和玻璃珠的三角燒瓶中,逐步稀釋制成10-2,10-3,10-4,10-5的土壤溶液;然后,各取0.1 mL的土壤溶液接種在PDA培養(yǎng)基的平板上,用涂布棒涂布均勻后,在30℃培養(yǎng)3 d.

用無菌牙簽將產(chǎn)生的單菌落接種到初篩培養(yǎng)基的平板上,于30℃培養(yǎng)5 d;然后,將產(chǎn)生透明圈的菌落用劃線分離的方法再一次接種于初篩培養(yǎng)基的平板上,培養(yǎng)4 d得到純菌落平板.最后,從純菌落平板上選取1株透明圈最大的菌種,接種于50 mL的PDA種子培養(yǎng)基,于30℃培養(yǎng)1 d后以體積比為4%的接種量接于50 mL復(fù)篩培養(yǎng)基中,于30℃培養(yǎng)7 d,每24 h取樣1次測定酶活.

在馬鈴薯瓊脂平板上培養(yǎng)菌株,觀察菌落培養(yǎng)特征和顯微形態(tài),對其進(jìn)行鑒定.

1.3 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

采用單因素輪換法,考察碳源、氮源、麥麩濃度、硝酸鈉濃度、培養(yǎng)溫度和發(fā)酵時間等因素對產(chǎn)酶量的影響,并對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化.每次試驗(yàn)中只變化一個因素的水平,其他因素的水平保持固定不變,得到的每個因素的最優(yōu)水平用于后續(xù)試驗(yàn),逐一考察每個因素對產(chǎn)酶的影響,最終得到最優(yōu)的發(fā)酵條件.

1.4 粗酶液的制備

取1 mL發(fā)酵液于4℃,10 000 r·min-1離心10 min,上清液即為粗酶液.

1.5 阿魏酸酯酶活力的測定

取250μL粗酶液于2 m L離心管中,于50℃保溫5 min;然后,加入250μL一定濃度的阿魏酸甲酯溶液,反應(yīng)10 min,再加入體積比為10%的500μL的冰乙酸終止反應(yīng).樣品離心后于4℃保存,用高效液相色譜(HPLC)法測定樣品中的阿魏酸含量.空白樣品中冰乙酸在反應(yīng)前加入,其他處理同上.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種篩選

經(jīng)過篩選得到1株阿魏酸酯酶活力較高的菌株,在初篩平板上培養(yǎng)3 d后產(chǎn)生明顯的透明圈,如圖1所示.圖2為菌株的液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶曲線.從圖2可知,第3 d開始產(chǎn)酶,隨后酶活穩(wěn)定,至第7 d開始下降.菌株在馬鈴薯培養(yǎng)基上生長3 d后,菌落中部呈黃綠色,分生孢子頭呈半圓形,小梗1層,頂囊半球形.初步鑒定其屬于真菌門、半知菌類、叢梗孢目、叢梗孢科、曲霉族、曲霉屬、黃-米曲霉組.

圖1 培養(yǎng)3 d后初篩平板中的菌落形態(tài)Fig.1 Colony mo rphology in first screening plate after 3 d

圖2 真菌的液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶曲線Fig.2 Time-course of feruloyl esterase of fungus liquid fermentation

2.2 產(chǎn)酶條件對產(chǎn)酶的影響

2.2.1 碳源和氮源 將種子液接種于不同種類碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中,于200 r·min-1,30℃下培養(yǎng)3 d后取樣測定酶活.考察不同碳源和氮源對產(chǎn)酶的影響,結(jié)果如表1所示.

從表1可知,麥麩的發(fā)酵產(chǎn)酶最高,是脫淀粉麥麩發(fā)酵產(chǎn)酶的184%,表明去除麥麩中的淀粉后進(jìn)行發(fā)酵,產(chǎn)酶量下降.但是,以淀粉為唯一碳源發(fā)酵,其結(jié)果與以木糖為唯一碳源一樣,都不產(chǎn)阿魏酸酯酶.這與Shin等[12]的報(bào)道結(jié)果一致,其原因可能與誘導(dǎo)機(jī)制有關(guān).麥麩中的淀粉可能僅僅有利于發(fā)酵初期菌體的生長,對阿魏酸酯酶的產(chǎn)生無誘導(dǎo)作用.

從表1可知,添加有機(jī)氮源(如酵母粉和蛋白胨)進(jìn)行發(fā)酵,產(chǎn)酶普遍高于添加無機(jī)氮源(如酒石酸銨、氯化銨和硝酸銨),但硝酸鈉除外.以硝酸鈉為氮源進(jìn)行發(fā)酵,產(chǎn)酶最高.

表1 碳源和氮源對產(chǎn)酶的影響Tab.1 Effectsof carbon sources and nitrogen sources on feruloyl esterase production

2.2.2 麥麩質(zhì)量體積比 考察不同麥麩質(zhì)量體積比w(麥麩)對產(chǎn)酶的影響,如圖3所示.從圖3可知,當(dāng)麥麩質(zhì)量體積比較低時,培養(yǎng)基中的麥麩不能滿足菌體生長的需要,酶活較低;當(dāng)麥麩質(zhì)量體積比為6%～8%時,產(chǎn)酶最高;進(jìn)一步提高麥麩濃度后,培養(yǎng)基中水含量減少,菌體的生長受到抑制,酶活降低.

2.2.3 硝酸鈉質(zhì)量體積比 考察了不同硝酸鈉質(zhì)量體積比w(硝酸鈉)對產(chǎn)酶的影響,結(jié)果如圖4所示.從圖4可知,當(dāng)硝酸鈉質(zhì)量體積比較低時,培養(yǎng)基中的硝酸鈉不能滿足菌體生長的需要,酶活較低;隨著硝酸鈉質(zhì)量體積比的增大,酶活逐漸提高;當(dāng)硝酸鈉質(zhì)量體積比為5%時,產(chǎn)酶最高;進(jìn)一步提高硝酸鈉質(zhì)量體積比,培養(yǎng)基中離子濃度增大,抑制了菌體的生長,酶活降低.

圖3 麥麩質(zhì)量體積比對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of w heat bran mass/volume on feruloyl esterase production

圖4 硝酸鈉質(zhì)量體積比對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of sodium sulfate mass/volume on feruloyl esterase production

2.2.4 培養(yǎng)溫度 不同培養(yǎng)溫度(θ)對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響,如圖5所示.從圖5可知,當(dāng)溫度為24℃時,產(chǎn)酶較少;隨著溫度的提高,酶產(chǎn)量增大;溫度為30℃時產(chǎn)酶最多,溫度至33℃時酶活略有下降.

2.3 發(fā)酵產(chǎn)酶時間曲線

考察了菌株產(chǎn)酶的時間曲線,如圖6所示.從圖6可知,發(fā)酵至第3 d開始產(chǎn)酶,并以每天約10%的速度增長;發(fā)酵至第6 d達(dá)到最高,酶活為16.33μkat·L-1,隨后開始下降.

圖5 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of cultivation temperature on feruloyl esterase production

圖6 發(fā)酵產(chǎn)酶的時間曲線Fig.6 Time-course of feruloyl esterase production

3 結(jié)束語

通過富集培養(yǎng)、梯度稀釋、平板初篩和搖瓶復(fù)篩的方法,從土壤中得到1株阿魏酸酯酶活力較高的菌株,初步鑒定為曲霉.運(yùn)用單因素法對其液態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化,酶活最高可達(dá)16.33μkat· L-1,為阿魏酸酯酶的進(jìn)一步研究打下了良好的基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯:黃曉楠英文審校:劉源崗)

Screen ing of Feruloyl Esterases Producing Strain and Optim ization of the Enzyme Production

DENG Yi-tao,L IXia-lan,CHEN Zong-xiang,CA IE-na
(College of Chemical Engineering,Huaqiao University,Quanzhou 362021,China)

A strain producing feruloyl esterases was obtained from the soil.It was preliminarily identified asAspergillus sp.according to the morphological characteristics.Production of feruloyl estserses was op timized by single facto r method.Results showed that the highest enzyme activity could reach 16.33μkat·L-1after 6 days at 30℃in Czapek medium containing 6%(mass/volume)w heat bran and 5%(mass/volume)sodium nitrate.

ferulic acid;feruloyl esterase;Aspergillus sp.;screening

Q 556.1

A

1000-5013(2011)03-0300-04

2010-04-23

李夏蘭(1965-),女,教授,主要從事生物化工的研究.E-mail:xialan@hqu.edu.cn.