SYK基因激活對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞株VEGF表達(dá)的影響

于慶功,鄭清華,李明強(qiáng),舒 敏,王 偉,劉春英

(大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化科,遼寧大連116001)

在我國(guó),絕大部分胃癌患者就診時(shí)已屬晚期,其治療難點(diǎn)之一是如何預(yù)防和治療腫瘤的轉(zhuǎn)移。脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)是B細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的激酶,與T細(xì)胞的ZAP-70屬于同一個(gè)PTK家族,在T細(xì)胞和B細(xì)胞的成熟、活化、免疫應(yīng)答的過(guò)程中起關(guān)鍵作用[1]。有研究認(rèn)為Syk不但是免疫調(diào)節(jié)因子,對(duì)惡性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移也可能有抑制作用[2]。國(guó)內(nèi)外研究已證實(shí),Syk能夠抑制乳腺腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,Syk基因的表達(dá)降低或缺失與正常乳腺組織向惡性細(xì)胞發(fā)展有關(guān)[3]。有研究認(rèn)為Syk基因是胃癌的抑制基因[4],其表達(dá)缺失與胃癌的發(fā)生以及轉(zhuǎn)移相關(guān),但其缺失的原因至今未明。抑癌基因啟動(dòng)區(qū)CpG島(基因啟動(dòng)子內(nèi)含有的CpG,C-G相鄰,p為二酯鍵)的甲基化是抑癌基因表達(dá)缺失的主要原因之一[5],而甲基轉(zhuǎn)移酶(DAN methyltransferase enxyme,DNMT)抑制劑 5-氮2'-脫氧胞苷(5-aza-CDR)具有逆轉(zhuǎn)SYK基因甲基化的作用[6]。為了進(jìn)一步研究Syk基因的表達(dá)對(duì)胃癌的生物學(xué)作用,本研究擬探索5-氮2'-脫氧胞苷(5-aza-CDR)能否逆轉(zhuǎn)人胃癌SGC-7901細(xì)胞株Syk基因的甲基化,激活的Syk基因是否對(duì)胃癌的生長(zhǎng)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)有抑制作用,從而探討Syk基因抑制胃癌的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌SGC-7901細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生化所;5-氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-CDR)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,用含氯化鈉的磷酸鹽緩沖液(pH6.8)配制成貯存液,-70℃保存。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌SGC7901細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清,100 IU/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素的RPM1640培養(yǎng)液中,于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3-4天用0.25%胰蛋白酶消化傳代1次。

1.2.2 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取1×105/ml的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,配成密度為1×104/ml的細(xì)胞使用液,分別接種于3塊96孔培養(yǎng)板,每塊板分5組,每組3復(fù)孔,每孔200 μ l,另取3個(gè)孔加入不含細(xì)胞的培養(yǎng)液100 μ l作為空白調(diào)零。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜,細(xì)胞完全貼壁后,小心吸棄培養(yǎng)液同時(shí)進(jìn)行分組處理:(1)空白對(duì)照組只加培養(yǎng)液;(2)0.5 μ mol/L 5-aza-CDR 組 ;(3)1.0 μ mol/L 5-aza-CDR 組 ;(4)2.0 μ mol/L 5-aza-CDR 組 ;(5)4.0 μ mol/L 5-aza-CDR組(0.5-4.0 μ mol/L為5-aza-CDR在培養(yǎng)液中的濃度)。培養(yǎng)3天后去藥,加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),自去藥開(kāi)始每隔24 h取出一塊板,每孔加入0.5%MTT液20 μ l,再培養(yǎng)4 h后,小心吸除孔內(nèi)液體,每孔加入二甲基亞砜150 μ l,立即置入自動(dòng)酶標(biāo)儀中,震蕩后于492 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度值(A492)。

1.2.3 RT-PCR 將密度為1×105/ml的細(xì)胞接種于12個(gè)25 cm2培養(yǎng)瓶,每瓶10 ml,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后,棄去原有培養(yǎng)液,PBS溶液沖洗2次。分成4組,每組3瓶,換液后每瓶仍為10 ml。分組情況以及所更換含藥培養(yǎng)液中藥物終濃度如下:(1)空白對(duì)照組只加培養(yǎng)液;(2)0.5 μ mol/L 5-aza-CDR 組 ;(3)1.0 μ mol/L 5-aza-CDR 組 ;(4)2.0 μ mol/L 5-aza-CDR組。培養(yǎng)3天后去藥,加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)3天。按TRIZOL(Gibco)說(shuō)明書操作分別提取不同藥物濃度作用后的SGC7901細(xì)胞總RNA。檢測(cè)人胃癌SGC7901細(xì)胞株Syk基因的表達(dá)情況:引物正義鏈:5'-AAGCAAATGTCAGTCAGTCATGCAGCAG-3'Syk反義鏈:5'-TCATCCCTCGATATGGCTTC-3',擴(kuò)增產(chǎn)物大小471 bp,94℃預(yù)變性5 min,94℃變性45 s,61℃退火1 min,72℃延伸45 s,30個(gè)循環(huán)后72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物-70℃保存。檢測(cè)細(xì)胞VEGF的表達(dá):(1)cDNA的合成:oligdT 1 μ l,dNTP 1 μ l,逆轉(zhuǎn)錄緩沖液 5 μ l,DEPC-H2O 6.5 μ l,RNA 10 μ l,Rnasin 0.5 μ l,MMV 1 μ l。 置于37℃水浴2 h,95℃5 min。(2)PCR:VEGF上游引物5'-ATGAACTTTCTGCTGTCTTG-3',下游引物5'-TGCATGGTGATGTTGGAC-3',擴(kuò)增產(chǎn)物大小382 bp,內(nèi)參β-actin的上游引物為:5'-GGGACCTGACTGACTACCTC-3',下游引物為:5'-ACTCGTCATACTCCTGCTTGCTG-3',擴(kuò)增產(chǎn)物大小546 bp。VEGF和βactin上下游引物均由大連TaKaRa生物工程公司合成 。PCR 擴(kuò) 增體系 50 μ l。DEPC-H2O 41.5 μ l,PCR緩沖液 5 μ l,上下游引物各 1 μ l,cDNA 1 μ l,Taq 酶 0.5 μ l。PCR 反應(yīng)條件:變性95℃45 s,退火95℃45 s,54℃45 s,72℃45 s,循環(huán)35次。延伸72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物-70℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后,將膠板在凝膠成像分析系統(tǒng)下拍照并進(jìn)行定量分析。電泳過(guò)程重復(fù)3次,記錄定量分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

根據(jù)實(shí)驗(yàn)性質(zhì),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(MEAN±SD)表示,數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。組間比較用方差分析,P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

接受5-aza-CDR激活SYK基因作用后的人胃癌SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)增殖明顯受抑,細(xì)胞生長(zhǎng)增殖受抑制程度在一定藥物濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)時(shí)間、劑量依賴性。從數(shù)據(jù)分析中得出,相同時(shí)間,1.0 μ mol/L組第 2 天和第 3 天 、2.0 μ mol/L 組和 4.0 μ mol/L 組與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.01);相同濃度,與第1天相比較 ,1.0 μ mol/L 組第 3 天 、2.0 μ mol/L 組和 4.0 μ mol/L組第2、3天與第1天比較,增殖明顯受抑,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。另外,相同時(shí)間,對(duì)照組 與 0.5 μ mol/L 組相 比 、2.0 μ mol/L 組 與 4.0 μ mol/L組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果如表1所示(表1中天數(shù)為自去藥開(kāi)始算起)。

表1 MTT法檢測(cè)經(jīng)不同濃度5-aza-CDR激活SYK基因后人胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖情況

2.2 RT-PCR

空白對(duì)照組及0.5 μ mol/L 5-aza-CDR組無(wú) SYK目的基因片段表達(dá);1.0 μ mol/L 5-aza-CDR組及2.0 μ mol/L 5-aza-CDR組有SYK目的基因片段表達(dá),擴(kuò)增產(chǎn)物大小471 bp。4組均有VEGFmRNA的表達(dá),隨著5-aza-CDR濃度的升高VEGFmRNA的表達(dá)量呈遞減趨勢(shì)。定量分析結(jié)果顯示:各組SYK表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較,0.5 μ mol/L 5-aza-CDR組P＞0.05;1.0 μ mol/L 5-aza-CDR 組 P ＜0.05;2.0 μ mol/L 5-aza-CDR組 P＜0.01.如圖1、表2所示。

圖1 各組人胃癌SGC7901細(xì)胞Syk mRNA(左)、VEGFmRNA(右)電泳圖

表2 各濃度5-aza-CDR組與空白對(duì)照組人胃癌SGC7901細(xì)胞 VEGFmRNA表達(dá)水平(OD值)比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),去甲基化前的SGC7901細(xì)胞中沒(méi)有Syk基因的表達(dá),但用5-aza-CDR處理Syk表達(dá)陰性的SGC7901細(xì)胞后,即能檢測(cè)到Syk基因的表達(dá)。Syk基因及其表達(dá)的作用包括抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Olivier B[7]的研究認(rèn)為,Syk基因的表達(dá)產(chǎn)物可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制腫瘤生長(zhǎng);Ganapati H[7]的研究認(rèn)為Syk蛋白可通過(guò)抑制磷脂酰肌醇激酶活性抑制乳腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性。近來(lái)的研究認(rèn)為,Syk是內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的重要調(diào)控因素,故本實(shí)驗(yàn)利用5-aza-CDR對(duì)Syk基因激活的作用,觀察Syk基因的激活對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的影響,從而研究Syk基因的激活對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。研究發(fā)現(xiàn),用5-aza-CDR去甲基化的SGC7901細(xì)胞Syk基因表達(dá)激活的同時(shí),SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)增殖明顯受抑,細(xì)胞生長(zhǎng)增殖受抑制程度在一定藥物濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)時(shí)間、劑量依賴性。SGC-7901細(xì)胞VEGFmRNA的表達(dá)相應(yīng)減少,且隨著5-aza-CDR濃度的升高,VEGFmRNA的表達(dá)量呈遞減趨勢(shì)。因此,抑制VEGFmRNA的表達(dá)可能是SYK基因的激活抑制SGC-7901細(xì)胞株的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。除甲基化以外,Syk基因的沉寂有無(wú)其它基因及細(xì)胞因子的參與,表達(dá)缺失的原因等還有待進(jìn)一步研究。Syk抑制VEGFmRNA的表達(dá)以及抑制胃癌的增殖轉(zhuǎn)移具體作用機(jī)制尚不清楚,仍待進(jìn)一步研究,為防治胃癌癌及其他腫瘤提供新的分子學(xué)靶位。

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