細胞色素C及相關細胞凋亡蛋白、基因在原發性肝癌組織表達的臨床意義

陳 昊,陳乃玲,張春芳,張 昶,王紅霞*,趙文海

(1.連云港市第一人民醫院,江蘇連云港222002;2.北京軍區總醫院全軍肝病治療中心)

研究證實凋亡與腫瘤發生發展密切相關,但是內外凋亡通路中各凋亡調控蛋白與腫瘤惡性增殖的關系尚不甚明了。我們以原發性肝細胞癌(肝癌)作為觀察對象,研究 Caspase8、Bid 、Bcl-2、Bax、Cyt-C 和Caspase9等凋亡相關蛋白、基因在肝癌細胞的表達,并探討其臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料來源 標本來自連云港市第一人民醫院病理科存檔和尸檢蠟塊,診斷均經病理證實。肝癌組:50例,男 41例、女 9例,年齡 33-74歲、平均(52.84±9.15)歲。其中高分化組8例,中分化組35例,低分化組7例;參照Edmondson分級法進行病理分級[1],其中Ⅰ級4例,Ⅱ級24例,Ⅲ級22例。對照組:正常肝臟組織標本 30例,男 17例、女13例,年齡4-71歲、平均(41.53±18.20)歲。所有組織標本均經10%中性福爾馬林液固定,石蠟包埋,4 μ m厚切片。

1.2 試劑 Bax兔抗人多克隆抗體;人 Caspase8 mRNA,Bid mRNA,Bcl-2 mRNA,Cyt-c mRNA和Caspase9 mRNA原位分子雜交試劑盒;免疫組化二抗試劑盒均購自武漢博士德生物有限公司。

1.3 免疫組織化學和原位分子雜交 免疫組織化學和原位分子雜交染色均按照試劑說明書操作,以PBS代替一抗作為空白對照。結果判定及分析:采用半定量積分法判斷結果,具體操作如下:每張切片隨機選取10個高倍鏡視野,分析其陽性細胞數及著色強度。①陽性細胞百分數計分:陽性細胞數≤5%為0分,6%-25%為1分,26%-50%為2分,51%-75%為3分,＞75%為 4分;②著色強度積分,無色為0分,淡黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分。將①和②兩者積分相乘得到總積分,0分為陰性(-),1-4分為弱陽性(+),5-8分為陽性(++),9-12分為強陽性(+++)。

1.4 統計學處理 采用SPSS11.5統計學軟件和Excel 2003進行數據統計和分析,運用卡方檢驗比較各組間陽性表達率的差異,采用秩和檢驗和獨立樣本t檢驗比較各組間表達強度差異。檢驗水準α取0.05,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外凋亡通路中Caspase8、Bid的表達 Caspase8、Bid均陽性表達于細胞漿,染色彌散分布(圖1-2)。

Caspase8陽性表達率在肝癌組為76.0%(38/50),其中 +8例、++25例、+++5例;對照組為60.0%(18/30),其中 +10例、++6例、+++2例。Caspase8陽性表達率兩組間比較差異未見統計學意義(χ2=2.286,P＞0.05);但表達強度肝癌組高于對照組,差異有統計學意義(t=-2.483,P＜0.05)。Bid陽性表達率肝癌組為66%(33/50),其中+7例、++21例、+++5例;對照組為96.67%(29/30),其中+13例、++9例、+++7例。Bid陽性表達率對照組高于肝癌組,差異有統計學意義(χ2=10.112,P＜0.01),但表達強度比較差異未見統計學意義(t=1.833,P＞0.05)。

2.2 內凋亡通路中 Bcl-2、Bax、Cyt-C和Caspase9的表達 Bcl-2、Bax、Cyt-C與Caspase9均陽性表達于細胞漿,染色彌散分布(圖3-6)。

圖1 Caspase 8在肝癌細胞漿的陽性表達(ISH×400)

圖2 Bid在肝癌細胞漿的陽性表達表達(ISH×400)

圖3 Bcl-2在肝癌細胞漿的陽性(ISH×400)

圖4 Bax在肝癌細胞漿的陽性表達(SP×400)

圖5 Cyt-C在肝癌細胞漿的陽性表達(ISH×400)

圖6 Caspase 9在肝癌細胞漿的陽性表達(ISH×400)

Bcl-2陽性表達率在肝癌組為38%(19/50),其中+9例、++6例、+++4例;對照組為86.67%(26/30),其中+6例 、++15例 、+++5例 。Bcl-2兩組間陽性表達率和表達強度比較差異皆有統計學意義(χ2=18.045,P ＜0.01;t=5.075,P＜0.01),肝癌組低于對照組。Bax陽性表達率在肝癌組為70%(35/50),其中 +24例、++7例、+++4例;對照組為93.33%(28/30),其中 +12例、++13例、+++3例。Bax兩組間陽性表達率和表達強度比較差異皆有統計學意義(χ2=6.100,P＜0.05;t=3.296,＜0.01),肝癌組低于對照組。Cyt-C陽性表達率在肝癌組為78%(39/50),其中 +11 例 、++17 例 、+++11 例 ;對照組為63.33%(19/30),其中+6例、++10例、+++3例。Caspase9陽性表達率在肝癌組為66%(33/50),其中 +13例、++15例、+++5例;對照組為80.00%(24/30),其中 +7例、++13例、+++4例。Cyt-C和Caspase9在肝癌和對照組間陽性表達率和表達強度差異均未見統計學意義(Cyt-C:χ2=2.203,P＞0.05;t=-1.593,P ＞0.05)(Caspase9:χ2=1.794,P＞0.05;t=1.513,P＞0.05)。

2.3 肝癌組肝癌凋亡蛋白或基因與腫瘤分化程度、病理分級及有無淋巴結轉移的關系 Cyt-C陽性表達率在肝癌高分化組為87.5%(7/8)、中分化組為85.71%(30/35)、低分化組為 28.57%(2/7);中及低分化兩組間和高及低分化兩組間差異均有統計學意義(P分別＜0.01和＜0.05),但高及中分化兩組間差異未見統計學意義(P＞0.05)。Caspase8、Bid、Bcl-2、Bax和Caspase9的表達,在不同腫瘤分化程度、病理分級及有無淋巴結轉移組間差異均未見統計學意義(P＞0.05)(表1、2)。

3 討論

對抗和逃避凋亡是腫瘤發生發展的重要機制[2],因此化療、放療和分子靶向治療都是主要通過誘導凋亡來治療腫瘤的[3]。已知凋亡分為外源性的死亡受體通路和內源性的線粒體通路[4]。外源性凋亡通路主要是通過死亡受體與配體超家族相結合后激活胞內的Caspase8而誘導凋亡,Caspase8又可切割促凋亡蛋白Bid而激活內源性的線粒體通路促凋亡效應。內源性凋亡通路中Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的兩個重要代表成員,Bcl-2家族通過改變線粒體膜電位而使得線粒體孔道開放,進而釋放線粒體膜間的促凋亡蛋白Cyt-C,再逐級激活下游的效應Cas-pase9發揮凋亡效應[5]。Bcl-2屬于抑凋亡蛋白、Bax是促凋亡蛋白,兩者的組成比例決定細胞對凋亡的敏感性[6]。Cyt-C和Caspase9均為促凋亡蛋白。目前研究大都支持在腫瘤的惡性進展過程中,促凋亡蛋白表達降低,抑凋亡蛋白表達增高,從而使腫瘤細胞惡性增殖。但也有部分學者研究證實肝細胞癌組織中存在自發凋亡機制,并且也存在腫瘤細胞惡性程度越高凋亡指數越大的現象[7]。

表1 Cyt-C、Caspase8、Bid在肝癌組織陽性表達與病理分級、腫瘤分化程度、轉移的關系

表2 Bcl-2、Bax、Caspase9在肝癌組織陽性表達與病理分級、腫瘤分化程度、轉移的關系

本研究發現在肝癌的發生發展過程中,外源性死亡受體通路的促凋亡Caspase8在肝癌細胞表達強度升高,可能緣于肝癌中間質反應明顯,抗腫瘤的細胞毒性T細胞(CTL)、自然殺傷細胞(NK)活性強,激活了該通路,也即肝癌早期本就有高凋亡活性。促凋亡蛋白Bid的表達水平肝癌組低于對照組。已知Bid主要通過Caspase8的切割而發揮作用,但為何我們實驗得出兩者表達是呈負調節的?可能Bid的表達還受其它因素的調控,抑或是因肝癌細胞胞漿中的Bid被已升高的Caspase8切割為有活性的tBid,導致Bid表達下降?具體的機制待進一步研究。

本研究中內凋亡線粒體通路中的促凋亡蛋白Bax在肝癌組較正常組表達下降,促凋亡信號啟動減弱。還發現抑凋亡基因Bcl-2表達也呈下降趨勢,這與一些研究結論相悖。有研究發現烏蘇酸可以通過上調Bax表達,下調Bcl-2表達來誘導肝癌細胞株SMMC-7721促凋亡效應[8]。Ramakrishnan等[9]學者證實在肝癌細胞凋亡過程中,促凋亡蛋白Bax表達上調、抑凋亡蛋白Bcl-2表達下調,兩者此消彼長,從而促進肝癌細胞凋亡得以實現。我們分析上述差異的可能原因是在肝癌發生發展過程中,機體特殊的腫瘤內環境決定調節腫瘤生長增殖的機制是復雜多樣的,促進和抑制因素并存,而體外實驗研究肝癌細胞凋亡的作用因素比較單一。作者認為本研究Bcl-2與Bax變化方向雖一致,但Bcl-2/Bax比例偏倚可能決定以抑凋亡或促凋亡為主。但也有支持我們實驗結果的研究,有學者發現在結直腸腺瘤中都有Bcl-2表達,而在癌中卻有50%檢測不到Bcl-2表達[10]。結合本研究Cyt-C的表達所見推測肝癌細胞Bcl-2/Bax比例可能增高,提示肝癌細胞在內源性線粒體通路是以抑凋亡信號占優勢,從而促進肝癌的發生發展。Cyt-C在正常肝組織到肝癌組織的表達差異不明顯,但卻與腫瘤分化密切相關,即腫瘤分化程度越高,其表達相對增高,可能是因為Cyt-C是在內凋亡線粒體通路的開關分子Bcl-2家族激活后才發揮作用,因此Cyt-C的表達調節應該是肝癌發生過程中的晚期事件。下游的效應Caspase9未見表達差異,可能因其活性發揮是通過與Cyt-C和Apaf-1形成凋亡復合體激活凋亡,不是其單一因素作用之故。

已知CTL和NK細胞可表達和分泌Fas-配體(Fas-L),通過激活體內的外源性死亡受體通路從而清除促肝臟疾病發生發展的一系列異常細胞,如攜帶肝炎病毒的肝細胞和肝癌細胞[3]。本研究顯示在肝癌的發生發展過程中,早期可能是外源性死亡受體通路激活肝癌細胞的高凋亡活性,但同時在癌基因激活、抑癌基因失活等因素的綜合作用下,肝癌細胞的生物學活性仍是增殖高于凋亡。隨著腫瘤進展,Bcl-2和Bax比例發生動態變化,Cyt-C表達下降,內源性線粒體通路的促凋亡作用減弱導致腫瘤加速發展。提示肝癌的分子靶向治療在早期可通過加強外源性死亡受體通路的促凋亡作用、進展期則通過從內源性線粒體通路的源頭Bcl-2家族著手,應用分子生物學技術上調促凋亡蛋白、下調抗凋亡蛋白而使得Bcl-2/Bax向促凋亡方向發展,促進Cyt-C的釋放,進而促進腫瘤細胞凋亡作為臨床輔助治療手段。

[1]張友會,劉復生,劉彤華,等.中國腫瘤病理學分類(下卷)[M].科學技術文獻出版社出版,2001:230.

[2]程 亮,王 曦,張 杰,等.凋亡及其相關蛋白在腫瘤治療中的進展[J].中華病理學雜志,2009,9(38):639.

[3]Nicholson DW,Thornberry NA.Apoptosis.Life and death decisions[J].Science,2003,299(5604):214.

[4]Hotchkiss RS,Nicholson DW.Apoptosis and caspases regulate death and inflammation in sepsis[J].Nature Reviews-Immunology,2006,6:817.

[5]Malhi H,Gores GJ,Lemasters JJ..Apoptosis and Necrosis in the liver:A Tale of Two Deaths[J].Hepatology,2006,43(2 Suppl 1):S31.

[6]Bartek J,Lukas J.Cell biology.Balancing life-or-death decisions[J].Science,2006,314(5797):261.

[7]尹燕明,嘉慶亮,張 偉,等.肝細胞癌熱休克蛋白70過表達與自發性癌細胞凋亡[J].中華肝臟病雜志,2001,9(2):84.

[8]Yu YX,Gu ZL,Yin JL,et al.Ursolic acid induces human hepatoma cell line SMMC-7721 apoptosis via p53-dependent pathway[J].Chin Med J(Engl),2010 Jul;123(14):1915.

[9]Ramakrishnan G,Lo Muzio L,Elinos-B áez CM,et al.Silymarin inhibited proliferation and induced apoptosis in hepatic cancer cells[J].Cell Prolif,2009 Apr,42(2):229.

[10]湯禮貴,程若川.Bcl-2家族與結直腸癌[J].國外醫學分子生物學分冊,2003,25(3):168.