枳實、枳殼中辛弗林含量比較分析

黃偉，劉友平，趙祎姍，施學驕，張杰紅，彭月

枳實為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L．及其栽培變種或甜橙 C．sinensis Osbeck的干燥幼果［1］;目前，市場上銷售的枳實主流品種為酸橙枳實［2－3］。枳殼為蕓香科植物酸橙C．aurantium L．及其栽培變種的干燥未成熟果實［1］。現代研究表明枳實、枳殼類藥材中富含生物堿類成分，主要有脫氧腎上腺素(即對羥基福林，又名辛弗林(Synephfine))、乙酰去甲辛弗林(又名乙酰真蛸胺(N－aeetyloetopamine))、N－甲基酪胺(N－methyltyramine)、去甲腎上腺素(Noradrenaline)，喹諾啉(Qinoline)、那可汀(Nareotine)等［4］，其中以辛弗林、N－甲基酪胺含量較高。辛弗林是間接β－腎上腺素激動劑，它具有強心、增加心輸出量、改善心泵血功能及提高外周阻力、升高血壓的作用［5－8］;其化學結構和麻黃堿近似，意大利學者通過動物實驗證實辛弗林對人的身體健康存在潛在威脅，其毒副作用引人關注。枳實、枳殼藥材中辛弗林是其升壓作用的功效成分，但關于其質量控制方面的研究較少，特別是枳殼中辛弗林的質量控制急待研究。因此如何在保證藥效的前提下，制定該類藥材的標準，確保臨床用藥安全有效值得進一步研究。本文對枳實、枳殼中辛弗林含量進行比較研究，以期為二者的質量控制和臨床用藥提供現代科學參考依據。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

島津LC－10ATVP高效液相色譜儀(日本島津公司)，CLASS－VP工作站;紫外－可見分光光度計(上海天美科學儀器有限公司UV1100型);BP211D(十萬分之一)，BP121S(萬分之一)型電子分析天平(德國Sartorius公司)。

1．2 試劑

辛弗林對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用，批號0727－200004)，乙腈為色譜純(國藥集團化學試劑有限公司)，水為高純水，其余試劑為分析純。

1．3 樣品

枳實、枳殼藥材均由成都中醫藥大學標本館盧先明教授鑒定，鑒定結果、樣品采集時間、采集地及產地見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

大連依利特BDS C18色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流動相乙腈－磷酸水(取十二烷基硫酸鈉0.5 g，0.5 mL磷酸加水溶解并稀釋至500 mL，加入5 mmol·L－1三乙胺調pH值至2.5)(50:50)，流速1.0 mL·min－1，柱溫30℃，檢測波長225 nm。在上述條件下，辛弗林色譜峰能完全分離，色譜圖見圖1。以辛弗林峰計算理論板數不低于3000。

圖1 圖中A為樣品，B為辛弗林對照品

2.2 供試品溶液的制備

取樣品粗粉1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密取續濾液10 mL，蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，通過聚酰胺(60－90 目，2.5 g，內徑為1.5 cm，干法裝柱)，用水25 mL洗脫，收集洗脫液，轉移至25 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.3 對照品溶液的制備

取辛弗林對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成濃度為 0.188 mg·mL－1的溶液，即得。

2.4 測定波長的選擇

取辛弗林對照品溶液在200～400nm波長范圍進行掃描，在225 nm處有最大吸收峰，故選擇225 nm作為檢測波長。

2.5 線性關系的考察

精密吸取“2.1.3”項下對照品溶液 2、6、10、12、16 μl注入液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積積分值(y)為縱坐標，質量(x)為橫坐標進行線性回歸，得y=50522x－8041.6(R=0.9998)，結果表明:辛弗林的進樣量在0.376 mg～3.384 mg范圍內與各自的峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.6 精密度試驗

取同一份供試品溶液，連續進樣6次，記錄色譜流出信號。以辛弗林含量為考察對象，計算6次分析所得辛弗林含量，RSD小于0.5%。

2.7 穩定性試驗

取 S－1 號樣品供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8，12 h測定辛弗林含量，結果辛弗林的RSD為1.28%。表明供試品溶液在12h內穩定性良好。

2.8 重現性試驗

取同一批號藥材，按供試品方法制備供試品溶液6份，記錄色譜流出信號，計算6份樣品中辛弗林含量，RSD小于1.0%。

2.9 回收率試驗

取K－1號藥材粉末約0.25 g(含辛弗林1.65 mg)6份，精密稱定。各份中加入辛弗林對照品溶液10 mL(含辛弗林1.88 mg)，按“2.2”項下供試品制備方法制備樣品，測定辛弗林含量，計算回收率。所得回收率分別為 99.1%、99.8%、100.8%、99.0%、100.9% 和102.7%，RSD為1.4%。

2.10 樣品含量測定

分別取供試品溶液及辛弗林對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測定，記錄峰面積，按外標一點法計算樣品中辛弗林含量，結果見表1。

表1 枳實、枳殼樣品收集與辛弗林含量測定結果(n=2)

3 結果與討論

3.1 本實驗參考文獻報道以及藥典對枳實生物堿的純化方法，在枳殼樣品的處理上也通過聚酰胺進行了處理，在處理后枳殼中生物堿能夠得到很好的分離和富集。辛弗林為有機胺類生物堿，極性較大，用普通的色譜法無法達到良好的分離。因此采用離子對反相高效液相色譜法對其進行分離，流動相中加入十二烷基硫酸鈉、三乙胺作為離子對試劑，能達到良好的分離效果［9－10］。我們發現辛弗林在乙腈－磷酸水(取十二烷基硫酸鈉0.5 g，0.5 mL磷酸加水溶解并稀釋至500 mL，加入5 mmol·L－1三乙胺調 pH 值至2.5)(50:50)作為流動相時，與相鄰組分的分離度達到分離要求，能完全滿足色譜峰定量要求。

3.2 含量測定結果表明所測枳實樣品中辛弗林含量變化范圍為0.28% ～2.53%，平均含量為1.1%;枳殼樣品中辛弗林含量變化范圍為0.10% ～1.10%，平均含量為0.58%，枳實中辛弗林含量明顯高于枳殼。不同批次、產地枳實和枳殼間辛弗林含量差異較大，所測枳實、枳殼樣品中辛弗林含量高者是辛弗林含量低者的10倍多，如:購于四川省西南藥都藥材市場的S－1枳實樣品辛弗林含量為2.53%，S－2枳實樣品辛弗林含量為0.28%;購于四川省西南藥都K－2枳殼樣品辛弗林含量為1.12%，重慶璧山自采K－6枳殼樣品辛弗林含量為0.1%。不同采收期的枳殼樣品中辛弗林含量差異也較大，如:榮昌種植基地K－7枳殼10月份自采樣品中辛弗林的含量0.25%低于榮昌種植基地K－3枳殼8月份自采樣中辛弗林的含量0.45%。以上結果表明:不同批次、產地和不同采收時期的枳實、枳殼樣品中辛弗林含量差異均較大。目前枳殼中還未建立辛弗林的控制指標，因而枳殼中辛弗林的質量標準急待建立。本文對枳實、枳殼藥材中辛弗林含量進行比較分析，以期為制定該類藥材的質量標準提供現代科學依據。

3.3 辛弗林其化學結構近似麻黃堿，其毒副作用已有學者報道，該毒副作用應該引起重視。枳實、枳殼中均含有辛弗林，而且該類藥材中辛弗林的含量差異較大，含量高者可達2.53%，含量低者只有0.1%，因而在建立該類藥材的質量標準時應同時考慮辛弗林的臨床療效和毒副作用。本文的研究結果，對該類藥材安全有效的臨床應用具有參考價值。

［1］ 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)［S］．北京:中國醫藥科技出版社，2010:229．

［2］ 李勁松．枳實的研究概況［J］．福建中醫學院學報，2005，［3］ 10(15):51．

［3］ 蔡逸平，陳有根，范崔生．中藥枳殼、枳實類原植物調查及商藥材的鑒定［J］．中國中藥雜志，1999，24(5):259．

［4］ 蔡逸平，曹嵐，范崔生．枳殼類藥材化學成分研究簡報［J］．江西中醫藥，1998，29(6):46．

［5］ 戴漢云，熊正東．化學合成枳實有效成分對羥福林N－甲基酪胺臨床資料總結［J］．中國藥學雜志，1989，10(2):612．

［6］ 閻應舉．枳殼與枳實的藥理研究(第1、2次報告)．對腸管、子宮的作用．對血壓、腎容積、心臟、血管、泌尿及支氣管的作用［J］．中華醫學雜志，1955，8(5):433．

［7］ 胡盛珊，王大元，邱萍，等．枳實有效成分的藥理活性比較［J］．中草藥，1994，25(8):419．

［8］ 李紅芳，李丹明，瞿頌義，等．枳實和陳皮對兔離體主動脈平滑肌條作用機理探討［J］．中成藥，200l，23(9):659．

［9］ 王國榮．薄層掃描法測定酸橙枳實(殼)中辛弗林和N－甲基酪胺的含量［J］．藥物分析雜志，1994，14(4):48．

［10］賈曉斌．HPLC測定蘇州地區陳皮中辛弗林含量［J］．南京中醫藥大學學報，1999，15(1):27．