膠束電動(dòng)色譜法分析奶中兩種主要的共軛亞油酸異構(gòu)體

王臘梅,陳 燕,劉曉華,曹郁生

南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院,南昌 330047

膠束電動(dòng)色譜法分析奶中兩種主要的共軛亞油酸異構(gòu)體

王臘梅,陳 燕,劉曉華,曹郁生＊

南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院,南昌 330047

以膠束電動(dòng)色譜法對奶樣中共軛亞油酸主要的兩種異構(gòu)體進(jìn)行了分析。在優(yōu)化條件下 (80 mM pH 9.0的磷酸鹽緩沖液,54 mM SDS,4%(w/v)β-CD,8M尿素,4%(v/v)乙醇作為運(yùn)行緩沖液,分離電壓 25 kV,柱溫20℃),膠束電動(dòng)色譜可在 15 min內(nèi)對奶樣中兩種主要 CLA,即 9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA進(jìn)行分離測定,最低檢出限為 0.081 ng/mL。分析結(jié)果顯示,不同處理奶樣中的 CLA含量差異顯著 (P＜0.001),但 CLA的組成相近,其中的 10t,12c-CLA含量差異不顯著P=0.999,約為 3%;不同品種奶樣,如牛奶、水牛奶和羊奶中的 CLA含量差異顯著 (P＜0.001),其中 CLA含量次序?yàn)榕Ｄ?＞羊奶 ＞水牛奶,并且不同品種奶的 9c,11t-CLA與 10t,12c-CLA比例差異顯著 (P＜0.05)。

共軛亞油酸;奶;膠束電動(dòng)色譜法

Abstract:A micellar electrokinetic chromatography method was used to analyze the major conjugated linoleic acid(CLA)isomers in milk.Under the optimized conditions(80 mM borate(pH 9.0),54 mM sodium dodecyl sulphate,4%(w/v)β-cyclodextrin,8 M urea,4%(v/v)ethanol,25 kV and 20℃),the major CLA isomers 9c,11t-CLA and 10t,12c-CLA could be separatedwithin 15 min byMEKC.Limitof detection of thismethod is 0.081 ng/mL.The results indicated that there was a significant difference in the total CLA content among raw milks,pasteurized milk,UHT milk(P＜0.001).However,the content of 10t,12c-CLA from all samples was similar(3%).The result also showed there was a significant difference in the totalCLA content and 10t,12c-CLA content among the cow milk,goatmilk and buffalo milk.

Key words:conjugated linoleic acid;milk;micellar electrokinetic chromatography

共軛亞油酸(CLA)是一類位置和幾何異構(gòu)體十八碳共軛二烯酸的統(tǒng)稱。天然的 CLA主要存在于反芻動(dòng)物的奶和肉的脂肪中,含量很低,是一些食物中的天然成分。乳中有兩種重要的共軛亞油酸異構(gòu)體 9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA,已經(jīng)證明這兩種CLA有著有益的生理活性[1],如 9c,11t-CLA具有抗癌[2,3],抗粥樣動(dòng)脈硬化[4],免疫調(diào)節(jié)的功能。而10t,12c-CLA對動(dòng)物具有減肥和改善機(jī)體成分的作用,可以減少脂肪的合成[5,6]。這說明不同異構(gòu)體有不同的生理活性。建立可靠的分析方法對確定食品中共軛亞油酸異構(gòu)體組成,研究不同異構(gòu)體的生理活性及共扼亞油酸產(chǎn)品的研究、開發(fā)和生產(chǎn),都具有十分重要的意義。

目前,常用的分析 CLA的方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、傅立葉變換紅外光譜法等。高效液相色譜法存在著分析時(shí)間長、試劑消耗量大的缺點(diǎn),氣相色譜法存在著衍生化過程復(fù)雜的缺點(diǎn),而質(zhì)譜法和紅外光譜法都不能單獨(dú)使用來確定 CLA各種異構(gòu)體的組成。上世紀(jì)八十年代,Terabe等[7]發(fā)展的膠束電動(dòng)色譜 (micellar electrokinetic chromatography,MEKC)做為毛細(xì)管電泳技術(shù)的一種分離模式,由于其高靈敏度、高分辨率、高效、快速、易自動(dòng)化、污染小等優(yōu)點(diǎn),已迅速的應(yīng)用于生命科學(xué)、食品科學(xué)、毒理學(xué)、藥物學(xué)等領(lǐng)域。

乳是 CLA主要的天然來源,乳中 CLA的含量和組成常常受到季節(jié)、動(dòng)物品種、加工方法、儲(chǔ)存時(shí)間等因素的影響,快速準(zhǔn)確的檢測很有必要。本研究以膠束電動(dòng)色譜法對奶樣中兩種主要 CLA異構(gòu)體進(jìn)行分析,對檢測的方法、條件以及樣品處理進(jìn)行了優(yōu)化,并對幾種奶樣中的 CLA含量組成進(jìn)行了比較分析。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

十二烷基硫酸鈉、甲醇、硼酸、硼酸鈉、β-環(huán)糊精、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、乙醚、石油醚、硫酸鈉、尿素均為國產(chǎn)分析純。

9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA標(biāo)品 (南昌華興生物科技有限公司)。

1.2 儀器

PA/ECMDQ毛細(xì)管電泳系統(tǒng) (Beckman),熔融石英毛細(xì)管 (70 cm×100μm i.d.,Beckman),PB602-E電子精密天平 (Mettler Toledo),PB10 pH計(jì) (賽多利斯),TGL-16B臺(tái)式離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠),超純水制備器 (Mllipore),RK510S超聲波脫氣機(jī) (Bandelin),旋渦混合器 (上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠),氮吹儀,冰箱,超低溫冰箱。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 奶樣來源及取樣

鮮牛奶來自南昌市某奶站;巴氏殺菌牛奶、UHT牛奶購自某超市;羊奶為市售品牌巴氏殺菌羊奶;水牛奶來自廣西水牛研究所。

鮮牛奶和巴氏殺菌牛奶均當(dāng)日測樣,UHT(保質(zhì)期分別為 40 d和 6個(gè)月)奶為保存 1個(gè)月所測樣。各種奶樣分別隨機(jī)取 500 mL,作進(jìn)一步分析。

2.2 奶樣中乳脂的提取

奶樣低溫離心 (10000 r/min,15 min,4℃),取上層固體于三角瓶中,加入正己烷-異丙醇 (v/v,1∶1)混合液,超聲波處理 30 min,取上層,無水Na2SO4過濾干燥 (使用前 110℃烘干 30 min),N2吹去有機(jī)試劑,-20℃保存待用。

2.3 乳脂皂化處理[8]

取已提取乳脂,加入 1 M KOH-C2H5OH,60℃水浴 1 h,反應(yīng)結(jié)束后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除 C2H5OH,加水及乙醚適量 (乙醚除不皂化物),水層以 2 M H2SO4調(diào)至 pH=2.0令游離脂肪酸從水層游離,石油醚提游離脂肪酸兩次,以無水 Na2SO4干燥,使用前除去石油醚。

2.4 電解液配制

2.4.1 母液的配制[9]

配制 80 mM的硼酸鹽緩沖液 (配制于超純水中),pH值為 9.0;將 SDS配制于 Borate中,濃度為54 mM。構(gòu)成母液。

2.4.2 運(yùn)行緩沖液的配制

將β-CD、尿素、乙醇直接加入母液,構(gòu)成運(yùn)行緩沖液。β-CD濃度為 4%(w/v),尿素濃度為 8 M,乙醇濃度為 4%(v/v)。

2.5 膠束電動(dòng)色譜法分析 CLA條件

每次進(jìn)樣檢測前,依次用甲醇洗柱 2 min,超純水洗柱 2 min,1 M鹽酸洗柱 5 min,超純水洗柱 2 min,然后再用 1 M氫氧化鈉和超純水分別洗柱 10 min。

紫外檢測波長:233 nm;分離電壓:25 kV;毛細(xì)管柱溫:20℃;進(jìn)樣方式:壓力進(jìn)樣 0.5 psi.(l psi.=6894.76 Pa),10 s;陽極進(jìn)樣,陰極檢測。

在每個(gè)樣品電泳之間,用 0.1 M氫氧化鈉洗柱2 min、超純水洗柱 1 min、運(yùn)行緩沖液洗柱 4 min。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取 9c,11t-CLA及 10t,12c-CLA標(biāo)品,以甲醇溶解 ,分別配制為 2.5、5、29、40、100、200、400、800、1000μg/mL的 9個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液 ,按上述色譜條件經(jīng)過分析,測得其峰面積,以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,對峰面積和進(jìn)樣量進(jìn)行一元線性回歸分析。

2.7 最低檢出限

從檢測的最適濃度開始,降低進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品的濃度,直到得到儀器可定量的最低濃度,然后連續(xù)進(jìn)樣20次,計(jì)算其平均值,然后除以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的斜率,即為儀器的最低檢出限。

2.8 數(shù)據(jù)分析及處理

用軟件 SPSS16.0進(jìn)行方差分析及 t檢驗(yàn),顯著性水平取α=0.05。

3 結(jié)果與討論

3.1 電泳條件的優(yōu)化

參考劉曉華等報(bào)道的方法[9],對分離電壓、柱溫和進(jìn)樣時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。

3.1.1 進(jìn)樣時(shí)間

固定分離電壓和柱溫,考察進(jìn)樣時(shí)間對分離的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),盡管進(jìn)樣時(shí)間越短,分離度越好,峰形越好,但峰電流會(huì)隨進(jìn)樣時(shí)間而降低,峰的重現(xiàn)性會(huì)變差,影響分析的精確度。同時(shí),適當(dāng)?shù)脑黾舆M(jìn)樣時(shí)間,可保證峰的重現(xiàn)性及分析的靈敏度,但分離度會(huì)下降。綜合考慮以上,進(jìn)樣時(shí)間選擇為 10 s,通過分離電壓和柱溫的選擇來達(dá)到較好的分離分析效果。

3.1.2 分離電壓

分離電壓極大的影響著電滲流和焦耳熱,從而影響分離度。增加電壓會(huì)極大的減小出峰時(shí)間,達(dá)到較短的分析時(shí)間,但也會(huì)降低分離度。本實(shí)驗(yàn)的分離電壓選擇為 25 kV來改善分離度。

3.1.3 柱溫

隨柱溫的增加,緩沖液粘度降低,電滲的速度加大,出峰時(shí)間會(huì)顯著降低,分離度也會(huì)下降。本實(shí)驗(yàn)的柱溫選擇為 20℃來達(dá)到較短的出峰時(shí)間。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取不同濃度的 9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA標(biāo)品進(jìn)樣,以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,對峰面積和進(jìn)樣量進(jìn)行一元線性回歸分析。9c,11t-CLA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 1所示,y=731.21x+2872.6,R2=0.9977,說明在 2.5～1000 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系,在該濃度范圍內(nèi)可用于 CLA的定量分析。

10t,12c-CLA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 2所示,y=727.74x+4655.1,R2=0.9974,說明在 2.5～1000μg/mL范圍內(nèi)MEKC分析的峰面積同 10t,12c-CLA的進(jìn)樣濃度呈良好線性關(guān)系,可在該濃度范圍內(nèi)用于 CLA的定量分析。

圖1 9c,11t-CLA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of 9c,11t-CLA

圖2 10t,12c-CLA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of 10t,12c-CLA

3.3 方法精密度

取 9c,11t-CLA標(biāo)品,以甲醇溶解,制備不同濃度的溶液,在 233 nm下測定,重復(fù)進(jìn)樣 3次,得出峰面積和保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD),結(jié)果如表所示。

表1 MEKC法分析 9c,11t-CLA的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Relative standard deviation of 9c,11t-CLA deter mined byMEKC

由表可以看出,峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.459%～3.205%,保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.962%～1.822%。

3.4 方法回收率

取不同奶樣進(jìn)行乳脂提取,并經(jīng)過皂化處理,分別加 9c,11t-CLA標(biāo)品,在 233 nm下測定,重復(fù)進(jìn)樣5次,計(jì)算回收率,結(jié)果如表所示。

表2 MEKC法分析 9c,11t-CLA的回收率Table 2 Recovery rate of CLA determined byMEKC

2 100.530 100 200.405 99.875 3 203.724 100 307.968 104.244 4 283.639 200 483.113 99.737 5 318.943 200 509.823 95.440

由表可以看出,回收率為 95.440%～104.595%,RSD為 3.745%。

3.5 最低檢出限

取 9c,11t-CLA標(biāo)品稀釋,進(jìn)行MEKC分析。在響應(yīng)值為基線噪音三倍時(shí) (S/n=3),在 233 nm下測定,重復(fù)進(jìn)樣 20次,平均值為 59.49 ng/mL,根據(jù)下式計(jì)算最低檢出限:

最低檢出限 =s/b=59.49/731.21=0.081 ng/mL

經(jīng)計(jì)算,該方法的最低檢測限為 0.081 ng/mL,可用于低濃度樣品的分析測定。

3.6 MEKC對共軛亞油酸兩種異構(gòu)體標(biāo)品的分離

取 9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA標(biāo)品配為混合標(biāo)品,在優(yōu)化條件下以 MEKC分析,兩種異構(gòu)體可以得到有效分離,其出峰時(shí)間分別是:10t,12c-CLA為 10.5分;9c,11t-CLA為 11.0分 (圖 3),分析時(shí)間不足 15 min,可用于大批量樣品的 CLA分析測定。

圖3 優(yōu)化條件下MEKC分離 9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA標(biāo)品Fig.3 Chromatogram of the mixture of 9c,11t-CLA and10t,12c-CLA

3.7 MEKC法測定奶樣中的 CLA

取不同奶樣提取乳脂,經(jīng)皂化處理,在優(yōu)化條件下用MEKC進(jìn)行分析。從圖 4可見共軛亞油酸最大吸收波長為 233 nm。

圖4 MEKC分析奶樣的最大吸收波長Fig.4 Chromatogram of samples

對奶樣中 CLA進(jìn)行分析的MEKC圖如圖 5所示,根據(jù)標(biāo)品的出峰時(shí)間判斷該奶樣中含有 9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA。

圖5 奶樣中 CLA的MEKC分析圖譜Fig.5 Chromatogram of samples analyzed byMEKC

在優(yōu)化條件下對鮮奶、巴氏奶、UHT奶中的CLA異構(gòu)體進(jìn)行分析測定,結(jié)果如表 3所示。鮮奶、巴氏奶和 UHT奶中的 CLA含量差異顯著 (P＜0.001),其 CLA含量次序?yàn)轷r奶 ＞巴氏奶 ＞UHT奶;但 CLA的組成相近,其中的 10t,12c-CLA含量差異不顯著 (P=0.999),約為 3%。

表3 MEKC法對不同處理奶樣中 CLA異構(gòu)體的含量測定 (n=7)Table 3 CLA contents of different samples deter mined byMEKC(n=7)

在優(yōu)化條件下對牛奶、水牛奶、羊奶中的 CLA含量進(jìn)行分析測定,結(jié)果如表 4所示,牛奶、水牛奶、羊奶中的 CLA含量差異顯著 (P＜0.001),其中水牛奶的 CLA含量僅為 2.972 mg/g乳脂,但是,各奶樣中的乳脂率不同,有報(bào)道,每 100 mL水牛乳中可含有高達(dá) 8 g的脂肪,而羊奶和牛奶中這一數(shù)值僅為 3 g左右。并且,牛奶、水牛奶、羊奶中的 9c,11t-CLA與 10t,12c-CLA比例差異顯著 (P＜0.05),羊奶中 10t,12c-CLA含量較高為 3.189%,而牛奶中的10t,12c-CLA含量僅為 2.388%。

表4 MEKC法對不同品種的奶樣中 CLA異構(gòu)體的含量測定 (n=7)Table 4 CLA content of different an imalmilk samples determined byMEKC(n=7)

4 結(jié)論

對MEKC的分離條件進(jìn)行了優(yōu)化,最佳條件為:分離電壓 25 kV,柱溫 20℃,進(jìn)樣時(shí)間 10 s。在優(yōu)化的條件下,MEKC可對奶樣中的 9c,11t-CLA與10t,12c-CLA進(jìn)行較好的分離,出峰時(shí)間:10t,12c-CLA為 10.5分;9c,11t-CLA為 11.0分,分析時(shí)間不到 15 min,適合大批量樣品的快速分析。峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 1.459%～3.205%,保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.962%～1.822%,回收率為98.105%～103.054%,說明該方法的精密度和準(zhǔn)確度均較好。因此 MEKC法可用于奶樣中 9c,11t-CLA 10t,12c-CLA兩種主要異構(gòu)體的分析測定,且該法的最低檢出限為 ng級(jí),更適合低濃度樣品的分析。

以MEKC法對不同熱處理奶中的 CLA異構(gòu)體進(jìn)行分析,結(jié)果顯示鮮奶、巴氏奶中的 CLA含量較高,與 UHT奶差異顯著 (P＜0.001)。鮮奶中的CLA總含量高達(dá) 9.288 mg/g乳脂,巴氏奶略低,其CLA總含量為 9.129 mg/g乳脂,而 UHT奶中的CLA總含量最低,保質(zhì)期 40 d和 6個(gè)月的 UHT中總 CLA含量分別為 8.631 mg/g乳脂和 8.613 mg/g乳脂。各奶樣的 CLA組成相近,10t,12c-CLA含量差異不顯著P=0.999,約為 3%。以MEKC法對不同品種奶樣中的 CLA進(jìn)行分析,結(jié)果顯示不同品種奶,如檢測的牛奶、水牛奶、羊奶中的 CLA含量差異顯著 (P＜0.001),其 CLA含量分別為:牛奶樣為9.220 mg/g乳脂,水牛奶樣為 2.972 mg/g乳脂,羊奶樣為 6.054 mg/g乳脂,且 9c,11t-CLA與 10t,12c-CLA的含量和比例差異顯著 (P＜0.05)。

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Separation of Conjugated Linoleic Acid Isomers in Milk by Micellar Electrokinetic Chromatography

WANGLa-mei,CHEN Yan,L IU Xiao-hua,CAO Yu-sheng＊
State Key Laboratory of Food Science and Technology,Sino-Ger man Joint Research Institute,Nanchang University,Nanchang 330047,China

TS252.1;TS225.2

A

1001-6880(2011)01-0015-05

2010-04-02 接受日期:2010-10-14

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