利用bFGF包裹的納米磁性顆粒對大鼠急性骨骼肌鈍挫傷恢復(fù)過程中收縮應(yīng)力及MHC-Ⅱb表達影響研究

李驍君

利用bFGF包裹的納米磁性顆粒對大鼠急性骨骼肌鈍挫傷恢復(fù)過程中收縮應(yīng)力及MHC-Ⅱb表達影響研究

李驍君

利用納米磁性顆粒將bFGF定位于大鼠骨骼肌鈍挫傷部位，考察該方法對大鼠急性骨骼肌鈍挫傷恢復(fù)過程中收縮應(yīng)力及MHC-Ⅱb表達影響。研究結(jié)果表明，bFGF對大鼠腓腸肌鈍挫傷后第17、24天的收縮力有明顯提高。損傷后第2～10天，bFGF包裹組與其余各組之間的MHC-Ⅱb mRNA表達差異顯著（P＜0.05）。因此，磁納米化的bFGF能明顯改善大鼠急性骨骼肌鈍挫傷后的收縮應(yīng)力衰減，顯著促進損傷肌肉MHC-Ⅱb mRNA的表達，改善損傷肌肉再生和結(jié)構(gòu)修復(fù)。

納米磁顆粒；堿性成纖維細胞生長因子；骨骼肌鈍挫傷MHC-Ⅱb

肌肉損傷是運動過程中難以避免的一類運動損傷[1－4]。運動創(chuàng)傷后，肌纖維遭到破壞，會產(chǎn)生微循環(huán)的紊亂及炎性細胞的浸潤及肌肉組織的血腫機化等，對運動員的運動能力、運動壽命均構(gòu)成了潛在威脅。研究表明，通過肌肉再生修復(fù)可以在一定程度上對肌肉功能有一定的恢復(fù)，但肌肉的結(jié)構(gòu)和功能完全康復(fù)存在一定難度[5]。近些年，隨著肌肉損傷研究的不斷深入，以及基因治療技術(shù)不斷增強，通過基因工程手段讓受損肌肉組織中潛在的衛(wèi)星細胞以及成纖維細胞更及時、更快地分化、增殖成為肌肉損傷恢復(fù)的一個新的研究課題。

堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）可以促進成纖維細胞增殖、分化，是肌肉早期再生過程中一種重要的生長因子[6]。研究表明，外源性bFGF對骨骼肌肌原細胞有明顯的增殖作用，從而加快損傷肌肉修復(fù)[7]，說明bFGF是一種有效的治療肌肉損傷分子制劑。因此，將bFGFs基因?qū)霌p傷部位并發(fā)揮作用，能夠彌補由于機體自身產(chǎn)生生長因子緩慢而有限的缺點，為肌肉損傷恢復(fù)提供更加充足的堿性成纖維細胞生長因子，從而促進肌肉再生過程。本研究通過利用bFGF包裹磁性（Fe3O4）納米粒，皮下注射急性骨骼肌鈍挫傷大鼠模型，在外加磁場（永磁梯度場）的牽引下靶向聚焦至肌肉損傷部位。通過對骨骼肌鈍挫傷后的收縮力特性的測試研究，及對腓腸?、騜型肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain－Ⅱb，MHC－Ⅱb）mRNA表達的影響，探討靶向定位的bFGF在骨骼肌再生和恢復(fù)過程中的促進作用，從而為其進一步的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 研究材料與方法

1.1 bFGF包裹磁性納米粒和小牛血清白蛋白（BSA）包裹磁性納米粒的制備

在本實驗中，免疫磁性納米粒制備試劑盒由北京金納信生物科技有限公司提供，按試劑盒使用說明書步驟進行操作。重組鼠堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）和小牛血清白蛋白（BSA）分別購自上海欣百諾生物科技有限公司和美國Sigmaaldrich公司。

1.2 實驗動物和分組

雄性Wistar大鼠126只，體重（210～230）g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。采用國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料飼養(yǎng)，自由攝食飲水，環(huán)境溫度（20～24）℃，相對濕度40%～60%，光照時間12 h。隨機分為bFGF包裹磁性納米粒組、BSA包裹磁性納米粒組、生理鹽水組及自然愈合組；依據(jù)不同的觀察時間點，每大組再分為4小組（損傷后第2、10、17、24和30天），每小組6只大鼠。另取6只未經(jīng)任何處理的大鼠作空白對照。

1.3 骨骼肌鈍挫傷模型的制備

參照陳世益等[8]的骨骼肌鈍挫傷模型制備方法，將雄性Wistar大鼠用10 g/L硫噴妥鈉麻醉后，重物下落導(dǎo)致一次打擊傷。致傷部位為右小腿內(nèi)側(cè)面（其皮下為腓腸肌中段），致傷物為一段固體木制圓柱體，打擊面直徑110 cm，下落物體長20 cm，質(zhì)量620 g，從40 cm高處落下，重力6108 N，動能2143 J。解剖證實骨骼肌鈍挫傷成功率達100%。

1.4 藥物處理

骨骼肌鈍挫傷后即刻，分別于損傷部位進行肌膜外注射bFGF包裹磁性納米粒、BSA包裹磁性納米粒或生理鹽水，注射量均為1 mL/（只·次），以后每隔7天注射一次，直至取樣測定。注射完畢，利用自制的磁靶向定位磁體裝置（見圖1）對損傷部位實施磁場牽引和聚焦，時間1 h。

圖1 磁靶向定位磁體裝置Figure 1 Homemade magnetic drug targeting apparatus

1.5 肌肉收縮力的測定和計算

分別于損傷后第2、10、17、24和30天隨機取材，6只（次·組）。實驗測定參照張勝年的方法[9]，即動物用0.5%戊巴比妥鈉麻醉后，令其俯臥固定十大鼠固定板上，分離其右側(cè)小腿后部皮膚及其表層肌肉、腱膜，使得肌肉收縮力測試在肌肉半離體狀態(tài)下進行。收縮力計算參照張勝年[8]的方法。

1.6 實時熒光定量PCR法測定大鼠MHC-ⅡbmRNA表達

采用Trizol（Invitrogen）法抽提大鼠腓腸肌總RNA，經(jīng)無RNA酶的DNase I（TaKaRa）處理，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，PCR檢測基因組DNA的消化情況，紫外分光光度計定量。取1.0 μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄（Superscript II，Invitrogen），以形成的cDNA第一鏈作為模板，使用Light cycler－faststart DNA master SYBR green I試劑（Roche），在Light Cycler PCR儀（Roche PTC－225）上進行實時熒光定量PCR擴增。PCR體系為：Mg2+濃度3 mmol/L，引物濃度0.4 μmmol/L，95℃變性10 min，95℃10 s，60℃5 s，72℃15 s，78℃測定熒光強度，40個循環(huán)；75℃至95℃繪制溶解曲線。

引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，以β－actin為內(nèi)參照，其正向引物：5'－TGC CGC ATC CTC TTC CTC－3'，反向引物：5'－CCA CAG GAT TCC ATA CCC AG－3'，擴增片段長度132 bp。MHC－Ⅱb正向引物：5'－TGG CAG AAT GGA AAC AGA AG－3'，反向引物：5'－TGC TCG GTC AGG TCA GAA AT－3'，擴增片段長度l87 bp。

實驗組與對照組樣品成對比較，ΔΔCT法相對定量。以內(nèi)參照的值進行歸一化處理。每組檢測6個平行樣，3次獨立的重復(fù)實驗相互驗證。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行分析，各組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用T檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 bFGF包裹磁性納米粒的制備

利用免疫磁性納米粒和bFGF，制備bFGF包裹的磁性納米粒。掃描電鏡結(jié)果顯示，磁性納米粒大小較均勻，平均直徑（100～120）nm（見圖2A）。磁滯回線（見圖2B）和紅外光譜（見圖2C）分析表明，bFGF包裹的磁性納米粒具順磁性質(zhì)，表面結(jié)構(gòu)上存在多羥基和羰基基團，具備良好的親水性和生物相容性。

圖2 制備的磁性納米粒藥物（A）及磁滯回線（B）和紅外光譜（C）分析Figure 2 Magnetic nanoparticles modified with bFGF and characterization with loop hysteresis and infrared spectrum

2.2 鈍挫傷肌肉收縮應(yīng)力的變化

如表1所示，與空白對照組相比，各組肌肉收縮力第2天均顯著降低（P＜0.05），到第10天及以后無顯著變化。與自然愈合組、生理鹽水組和BSA包裹磁性納米粒組相比，bFGF包裹磁性納米粒組收縮力在第17、24天時均顯著升高（P＜0.05），第17天達高峰。與空白對照組相比，盡管各組第30天收縮力略有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 大鼠腓腸肌鈍挫傷后收縮應(yīng)力的變化（n=6）Table 1 Changes in muscular contractive strength ingastrocnemius after contusion

2.3 各組處理對鈍挫傷大鼠腓腸肌MHC-Ⅱb mRNA表達的影響

設(shè)空白對照組的相對表達量為1（取對數(shù)后為0），故只比較自然愈合組、生理鹽水組、BSA包裹組、bFGF包裹組和bFGF直接注射組之間的MHC－Ⅱb mRNA表達情況。骨骼肌鈍挫傷后第2天，自然愈合組、生理鹽水組、BSA包裹組3組之間MHC－Ⅱb mRNA表達無顯著變化（P＞0.05），但bFGF包裹組&bFGF直接注射組與上述3組間表達差異顯著（P＜0.05），bFGF包裹組和bFGF直接注射組二者之間表達差異不顯著（P＞0.05）。損傷后第2天，自然愈合組、生理鹽水組和BSA包裹組的MHC－Ⅱb mRNA表達開始迅速上升，到損傷后第17天達到峰值。此后迅速下降，在損傷后第30天恢復(fù)到接近正常對照組水平。

圖3 各組處理對鈍挫傷大鼠腓腸肌MHC-ⅡbmRNA表達的影響Figure 3 Effects of treatments on the expressions of MHC-Ⅱb mRNA in gastrocnemius after contusion

損傷后第10天，bFGF包裹組的MHC－Ⅱb mRNA表達不僅仍顯著高于自然愈合組、生理鹽水組和BSA包裹組（P＜0.05），亦顯著高于bFGF直接注射組（P＜0.05）。損傷第17天后，其MHC－Ⅱb mRNA表達水平與上述四組無顯著差異（P＞0.05）。與自然愈合組等三組相比，bFGF包裹組和bFGF直接注射組的MHC－Ⅱb mRNA表達變化趨勢相似，均在損傷后第10～17天上升至峰值，然后迅速下降近正常表達水平。在損傷后第2天，bFGF包裹組的MHC－Ⅱb mRNA表達平均水平是自然愈合組的47.5倍，而bFGF直接注射組的MHC－Ⅱb mRNA表達平均水平是自然愈合組的44倍。

3 討論

骨骼肌損傷后，受損肌肉肌纖維壞死、水腫和血腫迅速形成，中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞浸潤，吞噬細胞殘骸，分泌細胞因子，肌衛(wèi)星細胞被激活并增生、分化，形成新的肌纖維[9]。堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）在創(chuàng)傷修復(fù)過程的3個階段，即局部炎癥反應(yīng)階段、細胞增殖分化及肉芽組織形成階段、組織重建階段均有不同程度的促進作用[10－12]。在炎癥期，bFGF對創(chuàng)傷細胞有明顯的趨向活性，刺激成纖維細胞，血管內(nèi)皮細胞等向創(chuàng)傷部位移動。當(dāng)細胞遷移至損傷部位時，開始進入增殖和修復(fù)期。肉芽組織的形成是非常關(guān)鍵的時期，其本質(zhì)是大量的毛細血管和豐富的成纖維細胞，bFGF正是成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞及血管平滑肌細胞的高效促生長劑，能夠顯著增加肉芽組織毛細血管數(shù)量和血液流量，改善創(chuàng)面微循環(huán)，為組織修復(fù)提供所必須的氧及豐富的營養(yǎng)物質(zhì)；同時，bFGF對損傷組織部位神經(jīng)纖維的再生也有顯著的促進作用，加速損傷組織功能的恢復(fù)[10－12]。

本研究利用免疫化學(xué)偶聯(lián)技術(shù)，以重組bFGF包裹磁性（Fe3O4）納米粒，注射急性骨骼肌鈍挫傷大鼠模型，在外加永磁梯度場的牽引下靶向聚焦至肌肉損傷部位。肌肉挫傷后，肌肉收縮力的下降取決于肌肉纖維的斷裂比例、炎癥反應(yīng)、痛疼痛反應(yīng)和中樞系統(tǒng)的反射控制。結(jié)果顯示，bFGF對大鼠腓腸肌鈍挫傷后第17、24天的收縮力有明顯提高；同時，bFGF在較短時間內(nèi)（損傷后第2天）即能使應(yīng)力松弛恢復(fù)接近正常肌肉水平。損傷后第17和24天，bFGF處理組恢復(fù)為正常肌肉的140%和131%。因此，從損傷肌肉的收縮力研究結(jié)果來看，bFGF一定程度上能促進大鼠急性骨骼肌鈍挫傷后肌肉再生和結(jié)構(gòu)修復(fù)，提高愈合質(zhì)量。

骨骼肌損傷修復(fù)過程中MHC－Ⅱb mRNA的表達結(jié)果顯示，與自然愈合組等相比，bFGF包裹組在傷后2～10天內(nèi)MHC－Ⅱb mRNA的表達快速上升并達到峰值；隨后迅速下降和恢復(fù)至正常水平。這表明bFGF促進大鼠急性骨骼肌鈍挫傷后肌肉再生和結(jié)構(gòu)修復(fù)與促進損傷肌肉MHC－Ⅱb mRNA的表達相關(guān)，其機制可能與bFGF是一種促細胞分裂劑、能調(diào)控和促進信號傳導(dǎo)分子的表達有關(guān)[14]。

本研究也顯示，攜載藥物的生物相容性磁性納米粒在外加永磁梯度場的牽引下，能較好地靶向定位于病灶區(qū)，發(fā)揮治療和修復(fù)作用。這對于進一步深入開展磁性納米藥物在運動醫(yī)學(xué)和創(chuàng)傷學(xué)上的應(yīng)用也提供了一個良好的嘗試和啟迪。

4 小結(jié)

堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）能明顯提高大鼠急性骨骼肌鈍挫傷后的收縮應(yīng)力衰減，顯著促進損傷肌肉MHC－Ⅱb mRNA的表達，改善損傷肌肉再生和結(jié)構(gòu)修復(fù)，提高愈合質(zhì)量。

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Muscle Contractive Strength and MHC-Ⅱb Express in Rat Skeletal Muscles after Acute Contusion by Using Basic Fibroblast Growth Factor-Coated Magnetic Nanoparticles

LI Xiaojun
（Dept.of Fundamental Theories，Shandong Sports University，Jinan 250063，China）

To study the effects of basic fibroblast growth factor（bFGF）－coated magnetic nanoparticles on the recovery and regeneration in rat skeletal muscles after acute contusion.bFGF could significantly increased the muscle contractive strength at day 17 and day 24 in gastrocnemius after contusion.From day 2 after contusion，bFGF could restore the muscle relaxation back close to the normal level.The bFGF－coated group was significantly different from other four groups in the expression of at day 2－10 after contusion（P＜0.05）.The bFGF－coated group could significantly enhance the contractive strength，promote the expression of MHC－Ⅱb mRNA，and improve the regeneration and structure healing of injured muscles in rat acute skeletal muscle contusion.

magnetic nanoparticle；bFGF；skeletal muscle contusion MHC－Ⅱb

G 804.5

A

1005-0000（2011）01-0034-03

2010-06-08；

2010-12-15；錄用時間：2010-12-20

山東省自然科學(xué)基金項目（項目編號：Y2007C116）

李驍君（1970-），男，山東濟南人，副教授，研究方向為運動與糖脂代謝、體能訓(xùn)練的機能應(yīng)答。

山東體育學(xué)院基礎(chǔ)理論系，山東濟南250063。