HPLC法測(cè)定鹽酸普萘洛爾片的含量

廣西桂林食品藥品檢驗(yàn)所（541002）趙純玉 王玲 易燕群

鹽酸普萘洛爾片常用于心血管病的治療。鹽酸普萘洛爾片收載于《中國(guó)藥典》2010年版二部，含量測(cè)定采用紫外分光光度法。筆者在工作中發(fā)現(xiàn)，紫外分光光度法專屬性不強(qiáng)，已有一些研究報(bào)道采用高效液相色譜法測(cè)定普萘洛爾片的含量，其峰型不是很滿意，與藥典方法比較結(jié)果偏低。本研究測(cè)定鹽酸普萘洛爾片含量的HPLC-外標(biāo)法，克服了上述不足，方法簡(jiǎn)便快速，準(zhǔn)確可靠。

1 儀器與試藥

島津LC-2010AHT液相色譜；TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；AB265-S電子分析天平；SartoriusPb-10pH計(jì)；鹽酸普萘洛爾對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為100783-200401），鹽酸普萘洛爾片（山西云鵬制藥有限公司，批號(hào)為B071002，B080104）；甲醇、庚烷磺酸鈉（色譜純），磷酸二氫鉀（分析純），純化水（自備）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：SHIMADZU Shimpack VP-ODS C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-含0.1%庚烷磺酸鈉的0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（57∶43）；流速：1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：290nm；進(jìn)樣量：10μl；柱溫：30℃。

2.2 溶液配制 取鹽酸普萘洛爾片20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量 （約相當(dāng)于鹽酸普萘洛爾10mg），置50ml量瓶中，加水2ml，振搖5mim使溶解，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。精密稱取鹽酸普萘洛爾對(duì)照品約10mg，置50ml量瓶中，加水2ml，振搖5mim使溶解，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.3 測(cè)定法 精密量取供試品溶液與對(duì)照品溶液各10μl，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察：精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白溶劑各10μl，分別注入高效液相色譜儀。供試品溶液色譜中結(jié)果，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰，空白溶劑在此保留時(shí)間處無(wú)相應(yīng)色譜峰，表明其對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾。見(jiàn)附圖。

2.4.2 線性關(guān)系考察：取鹽酸普萘洛爾對(duì)照品制成濃度為50、100、200、300、400、500μg/ml的系列溶液，精密量取10μl分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以鹽酸普萘洛爾濃度X（μg）對(duì)峰面積（Y）進(jìn)行回歸，得回歸方程Y=20455X+493511，r=0.9999 （n=6）。結(jié)果表明，鹽酸普萘洛爾濃度在50.17～501.7μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度試驗(yàn)：取同一供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，以鹽酸普萘洛爾的主峰面積計(jì)算，RSD＝1.09%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液（批號(hào)：B080104），分別在室溫放置0、12、24、48、72h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定峰面積，結(jié)果鹽酸普萘洛爾平均含量為102.16%，RSD＝1.95%（n＝5），表明供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)：B071002），按“2.2”項(xiàng)下依法制備供試品溶液5份，分別按“2.3”項(xiàng)下測(cè)定，結(jié)果鹽酸普萘洛爾平均含量為104.24%，RSD＝0.9%（n＝5），表明該方法重復(fù)性較好。

2.4.6 耐用性考察：取同一供試品溶液，在不同流動(dòng)相比例、不同柱溫、不同色譜柱及不同儀器等不同條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果平均標(biāo)示量為101.72%，RSD＝1.27%，表明耐用性良好。見(jiàn)附表1。

2.4.7 加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為B071002），研細(xì)，精密稱取適量，置250ml容量瓶中，加水2ml，振搖5mim使溶解，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1ml約相當(dāng)于鹽酸普萘洛爾0.1mg的溶液。精密量取稀釋后溶液5ml、10ml、20ml各3份，分別置于25ml容量瓶中，每瓶加入對(duì)照品適量，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜濾過(guò)，按照“2.3”項(xiàng)下測(cè)定含量，計(jì)算回收率。見(jiàn)附表2。

附表1 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

附表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

附表3 本法與中國(guó)藥典方法結(jié)果比較

2.5 本法與中國(guó)藥典方法比較 取同一廠家兩個(gè)批號(hào)的鹽酸普萘洛爾片，分別按本文方法及《中國(guó)藥典》2010年版二部收載的鹽酸普萘洛爾片含量測(cè)定方法（紫外-可見(jiàn)分光光度法）進(jìn)行比較。見(jiàn)附表3。

3 討論

3.1 本研究中的HPLC法對(duì)鹽酸普萘洛爾的定量結(jié)果與藥典方法結(jié)果基本一致，但較藥典方法更具專屬性，而且方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3.2 對(duì)鹽酸普萘洛爾的定量分析，文獻(xiàn)報(bào)道，方法有紫外分光光度法[1][2][3]、二階導(dǎo)數(shù)分光光度法[4]、高效液相色譜法[5]、量熱滴定法[6]、荷移光譜法[7]、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法[8]。高效液相色譜法是目前應(yīng)用較多的方法，筆者經(jīng)實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，本研究中的HPLC法出峰快，峰型好，穩(wěn)定性及耐用性強(qiáng)。

3.3 溶劑的選擇：鹽酸普萘洛爾在水或乙醇中溶解。但當(dāng)溶劑選擇純水、純乙醇、純甲醇或水醇混合液比例不當(dāng)時(shí)，HPLC色譜峰會(huì)出現(xiàn)雙峰。通過(guò)試驗(yàn)確證，《中國(guó)藥典》2010年版二部該品種含測(cè)項(xiàng)下規(guī)定，先用2ml水使溶解，再用甲醇稀釋，有利于鹽酸普萘洛爾的穩(wěn)定。

3.4 流動(dòng)相及配比的選擇：運(yùn)用不同比例的流動(dòng)相：①乙腈-水；②乙腈-0.02mol/L磷酸二氫鉀溶液；③甲醇-水；④甲醇-0.02mol/L磷酸二氫鉀溶液[9]；⑤甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液；⑥甲醇-含0.1%庚烷磺酸鈉的0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液用磷酸調(diào)pH為3.0；⑦乙腈-甲醇-0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液-三乙胺用磷酸調(diào)pH為3.3～3.4。進(jìn)行峰型，保留時(shí)間，理論塔板數(shù)，拖尾因子等因素的比較，結(jié)果表明，甲醇-含0.1%庚烷磺酸鈉的0.05mol/l磷酸二氫鉀溶液用磷酸調(diào)pH為3.0（57∶43）為佳，分離度好，分析時(shí)間不長(zhǎng)，主峰出峰時(shí)間約為10min。但當(dāng)流動(dòng)相的比例在43∶57時(shí)，主峰分岔出現(xiàn)雙峰，可能是S-（-）-鹽酸普萘洛爾與R-（+）-鹽酸普萘洛爾對(duì)映體[1]分離 。操作時(shí)應(yīng)控制好流動(dòng)相的比例。

3.5 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：取鹽酸普萘洛爾對(duì)照品溶液，用UV-1901型紫外分光光度計(jì)在200～500nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，結(jié)果在290nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，選擇此波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.6 柱溫的選擇：用同一供試液分別在柱溫25℃、30℃、35℃進(jìn)行色譜分析，結(jié)果30℃時(shí)其分離度、理論塔板數(shù)較好。因甲醇易揮發(fā)，故不宜采用太高柱溫。