微生物能力驗證樣品制備工藝及水產品企業水平測試結果評價

周向陽，王淑娜，鄢建輝，沈 飚，胡興娟，朱炳林

（1.舟山出入境檢驗檢疫局，浙江舟山 316000；2.杭州市原種場，浙江杭州 311115；3.浙江大學動物預防醫學研究所，浙江杭州 310029）

能力驗證是實驗室外部質量控制的有效措施之一，也是計量認證和實驗室認可的必備要求。水產品企業實驗室的微生物檢驗能力不僅關系著出口企業的經濟效益，也將影響到水產品的衛生與安全。為了進一步提高舟山市水產品企業微生物檢驗的工作質量，舟山出入境檢驗檢疫局科技認證處與舟山檢科分院合作，根據該巿檢驗檢疫工作的特點和水產品待檢項目的要求，選取了3個常規的檢測項目，即菌落總數、副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌檢測，于2009年對該巿88家水產品企業開展實驗室檢測能力驗證。

目前，微生物學檢驗領域尚無高可信度、高通量的微能力驗證制備技術，且在菌落總數的檢測項目上無標準菌株，這些微生物檢驗中的不確定性因素，使得實驗室間能力驗證的可信度打折[1]。同時，部分商品化的微生物能力驗證樣品價格比較昂貴，也不能完全符合某地區某類型水平測試的特點。有研究認為，冷凍干燥技術保存微生物可以維持細菌生物學特性，且樣品也易于保存和運輸，其在微生物能力驗證樣品的制備方面有良好應用前景[2]。因此，筆者探索并采用冷凍干燥技術制備了一批副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌檢測以及菌落計數的微生物能力驗證樣品，在對水產品企業實驗室進行檢驗水平測試的同時，也給這些企業實驗室檢測水平的進一步提高提供了建議。

1 材料與方法

1.1 微生物菌株

副溶血弧菌（VP）、擬態弧菌（VM）由浙江大學動物預防醫學研究所提供；金黃色葡萄球菌（SA）、表皮葡萄球菌（SE）由舟山出入境檢驗檢疫局水產品實驗室保存。

1.2 試劑與儀器

所用試劑有脫脂奶粉、甘油、NaCl、BHI培養基、TCBS瓊脂、Baird-Park瓊脂、冷凍保存液A（含8%奶粉、4%甘油、0.3%NaCl）、冷凍保存液B（含8%奶粉、4%甘油）等；主要儀器有生化培養箱、超凈工作臺、普通冷凍離心機、酶標儀、冷凍干燥機、低溫冰箱、超低溫冰箱等。

1.3 能力驗證樣品的制備方法

1.3.1 細菌的培養

副溶血弧菌、擬態弧菌在含3%NaCl的BHI培養基中培養5 h左右，2 000 r/min離心10 min，沉淀用冷凍保存液A混懸均勻，并調整OD600至0.3，兩菌等量混合后進行10倍梯度稀釋。金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌在BHI培養基中培養至對數生長期，離心后用冷凍保存液B混懸，調整OD600為0.4，等量混合并進行梯度稀釋。另外，取部分金黃色葡萄球菌混懸液，稀釋至合適濃度進行菌落總數的測定。

1.3.2 制備工藝

將調整好濃度的細菌混合/懸液分裝至安瓶，每瓶1mL；安瓶放于-20℃低溫預先凍結1 h，立即轉至-80℃超低溫冰箱冷凍12 h左右；提前2 h打開冷凍干燥機使冷凝器降至-40℃以下的工作溫度，抽真空并使真空度達100 μ Hg以上，然后將安瓶均勻置于冷凍室內擱板上，升華干燥50 h左右；待安瓶里內容物具有一定的物理形態，呈現乳白色疏松海綿狀，則改變儀器狀態進行解析干燥2 h，除去內容物里的結合水成分；進行封口、壓蓋、貼簽，并于4℃冰箱貯存。

1.3.3 能力驗證樣品的質量檢查

分別取制備好的微生物凍干樣品各10瓶，用營養肉湯復水后按照標準方法進行測定；4℃保存1個月后，同法測定，通過測定結果比較進行樣品均勻性與穩定性的驗證。

1.4 考核項目與要求

1.4.1 菌落總數

無菌開啟凍干樣品瓶蓋，用5 mL稀釋液溶解其中的凍干粉末，進行細菌總數的測定，也可參照SN/T 0168-1992《出口食品平板菌落計數》進行計數。

1.4.2 能力驗證樣品中致病菌的檢測

無菌開啟凍干樣品瓶蓋，用5 mL待檢菌生長適宜的營養肉湯溶解其中的凍干粉末，并置于36±1℃恒溫箱中培養8 h。為更好地分離到目標菌，建議在選擇性平板上進行劃線分離。其它步驟也可以參考現行國家或行業標準進行操作。

1.4.3 報告要求

所有參加考核的實驗室需在領取樣品一周后報告試驗結果，同時要提交詳細的檢驗原始記錄，并加蓋企業公章。若實驗室采用非標準方法，需對檢驗方法進行描述。

1.5 考核結果評價方法

參考GB/T 15483.1-1999標準，用國際上通用的穩健統計技術，即Z比分數進行評價和分析菌落總數[3-4]。當穩健Z比分數≤2為滿意值；2＜Z值＜3為尚可接受，為復查值；Z值≥3者為不滿意結果，為離群值。副溶血弧菌與擬態弧菌混合樣、金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌混合樣、部分干擾盲樣（不含待檢目標菌）為隨機發放，檢測過程中要結合細菌菌落形態、生化反應進行判斷，報告為檢出或未檢出。

2 結果

2.1 能力驗證樣品的制備結果

按照上述冷凍干燥工藝制備微生物能力驗證樣品后，每批取10個樣品依行業標準方法進行質量檢查。菌落計數結果經單因素方差分析[1]，方差比（F）值分別為1.82和1.67，小于F0.05的臨界值5.19，表明菌落計數樣品間金黃色葡萄球菌含量無顯著差異，其均勻性完全滿足水平測試的要求。能力驗證樣品中副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌的檢測結果均符合預期，生化試驗與真空冷凍干燥前期一致，且擬態弧菌和表皮葡萄球菌的含量也符合預設要求。另外，樣品于4℃條件下貯存1個月后重復檢測以上項目，菌落計數和致病菌檢測結果比對發現，細菌總數無明顯變化，細菌生化特性亦未改變，表明冷凍干燥樣品在4℃貯存時其穩定性符合要求。

2.2 菌落總數計數的考核結果

對舟山市88家水產品企業的兩批菌落總數計數結果進行統計學處理，分別計算出其中位數和穩健Z比分數，其中穩健Z比分數≤2的水產品企業72家，總體滿意率為81.8%；結果尚可接受數為6，占總企業數的6.8%；結果不滿意者為9家，占10.1%。水產品企業實驗室菌落總數考核結果統計分析見表1。

表1 舟山巿水產品企業菌落總數能力驗證結果分析Tab.1 The results of colony counting proficiency testing of aquatic enterprises in Zhoushan

2.3 病原菌檢測的考核結果

根據不同水產品出口地的菌種限量要求，參加金黃色葡萄球菌檢測項目的水產品企業（主要出口歐盟、美國、加拿大等）56個，參加副溶血弧菌檢測項目的水產品企業（主要出口日本、韓國等）32個。在干擾樣品和混合樣品中，副溶血弧菌檢測的正確率較為理想，高達93.8%；而金黃色葡萄球菌檢測的滿意率較低，僅為82.1%，主要是由于表皮葡萄球菌與金黃色葡萄球菌兩種細菌在Baird-Park瓊脂上的菌落形態相似，或者檢驗人員對金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶試驗結果判斷失誤。

表2 舟山巿水產品企業病原菌檢測能力驗證結果分析Tab.2 The results of pathogenic bacterial proficiency testing of aquatic enterprises in Zhoushan

2.4 水平測試結果的綜合評價

在參加能力驗證的88家水產品企業中，菌落總數與致病菌檢測的結果均不合格的企業3家。菌落總數計數是水產品中微生物檢驗的必檢項目，但仍有9家企業計數結果存在較大偏差。通過檢測報告分析，其原因有：樣品梯度稀釋不均勻；數據單位換算錯誤：實驗前未對所用容器、試劑進行無菌核查而引入了外源性微生物。致病菌檢測共有11家未達到檢測要求，其原因有：干擾菌的設置提高了檢測的難度；檢測人員對同屬細菌的鑒別經驗不足；對副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌的某些生化現象判斷不準等。另外，試驗過程中未進行空白對照實驗，未采用標準菌株進行確證試驗的不規范操作也很常見。

3 討論與分析

在冷凍干燥技術保存微生物研究的基礎上，我們探索并建立了冷凍干燥技術制備的微生物能力驗證樣品的工藝。針對副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌的最佳生長條件優化了不同濃度與共溶點的冷凍保存液A和冷凍保存液B，并篩選適合能力驗證樣品的合適的細菌濃度，研究了樣品在真空條件下升華干燥的時間，即50 h左右即可減少內容物里90%以上的水分，而時間過短或過長都會改變或影響內容物的物理狀態。結果顯示，本研究以金黃色葡萄球菌為目標菌所制備的菌落計數樣品均勻性和穩定性良好，用于致病菌檢測的樣品也符合質控盲樣的要求。另外，本研究對于冷凍干燥技術的探索，對于其它種類微生物能力驗證樣品的制備也提供了一定的技術參考。

能力驗證考核的是實驗室硬件與軟件的綜合實力。在硬件條件達標的情況下，只有不斷提高檢驗人員的檢測技術水平，才能實現對水產品原料或樣品中微生物的早發現早處理，并防止有安全隱患的水產品流入正常銷售渠道。綜合以上因素，舟山市水產品企業實驗室微生物的檢測能力正在不斷提高，但仍需從以下幾方面繼續加強實驗室檢驗質量控制工作：需要建立健全實驗室內部質量管理體系，制訂合理全面的檢驗規章制度；實驗室檢驗人員要加強業務素質培訓，定期參加實驗室檢測能力驗證；儀器設備、試劑使用前必須經過儀器狀態和試劑質量核查；試驗室與無菌操作環境也要定期監控與記錄[5]。

[1]盧行安,鄭 江,曹志軍,等.微生物能力驗證樣品均勻性試驗的研究[J].中國微生態學雜志,2003,15(1):33-34.

[2]董充慧,蘇 杭,張特立,等.真空冷凍干燥技術在生物制藥方面的應用[J].沈陽藥科大學學報,2009,26(7):76-78.

[3]GB/T 15483.1利用實驗室間比對的能力驗證：能力驗證計劃的建立和運作[M].北京：中國標準出版社,2004.

[4]HORWITZ W,BRITTON P,CHIRTEL S J.A simple method for evaluating data from an inter laboratory study[J].J AOAC Int,1998,81(6):1 257-1 265.

[5]張秀麗,廖興廣,張 蒙,等.2003年河南省食品衛生微生物檢驗質量控制考核結果的評價與分析[J].中國衛生檢驗雜志,2005,15(7):856-857.