丹酚酸B抑制氧化應(yīng)激引起骨髓間質(zhì)干細(xì)胞凋亡的研究*

盧碧燕， 童秀珍， 鄧宇斌△, 吳洪福, 侯景義

(中山大學(xué) 1中山醫(yī)學(xué)院病理生理教研室,2附屬第一醫(yī)院血液科,廣東 廣州 510080)

丹酚酸B抑制氧化應(yīng)激引起骨髓間質(zhì)干細(xì)胞凋亡的研究*

盧碧燕1， 童秀珍2， 鄧宇斌1△, 吳洪福1, 侯景義1

(中山大學(xué)1中山醫(yī)學(xué)院病理生理教研室,2附屬第一醫(yī)院血液科,廣東 廣州 510080)

目的觀察丹酚酸B (Sal B)對(duì)氧化應(yīng)激介導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)凋亡的影響并探討其作用機(jī)制。方法大鼠BMSCs培養(yǎng)鑒定后分為5組：空白對(duì)照組、氧化應(yīng)激組、低濃度Sal B+H2O2組、中濃度Sal B+H2O2組和高濃度Sal B+H2O2組。應(yīng)用MTT、流式細(xì)胞儀(FCM)及Hoechst標(biāo)記的方法檢測Sal B對(duì)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞活性下降以及凋亡效應(yīng)的影響；通過DCF熒光染色的方法檢測過氧化氫及Sal B對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧生成的影響；用Western blotting的方法檢測p-ERK1/2表達(dá)情況。結(jié)果MTT結(jié)果顯示不同濃度的Sal B共處理BMSCs 24 h能夠提高氧化應(yīng)激情況下的細(xì)胞活性，其中中濃度組的作用更為明顯。Hoechst標(biāo)記以及FCM檢測的結(jié)果表明：10 μmol/L Sal B處理能夠提高細(xì)胞活性，減少凋亡數(shù)。正常組細(xì)胞的DCF陽性細(xì)胞率為28.7%±8.1%，經(jīng)500 μmol/L H2O2刺激24 h后，陽性細(xì)胞數(shù)急劇上升，高達(dá)86.9%±12.4%。而10 μmol/L Sal B處理組的上升不明顯，僅有42.1%±10.8%。由此可見，Sal B處理可以減少細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成；細(xì)胞在氧化應(yīng)激的條件下p-ERK1/2在15 min內(nèi)開始上調(diào)，持續(xù)120 min。而這種上調(diào)經(jīng)10 μmol/L Sal B處理可以有效降低，同時(shí)Sal B可以降低細(xì)胞基礎(chǔ)的p-ERK1/2表達(dá)。結(jié)論Sal B 增強(qiáng)BMSCs抗氧化應(yīng)激能力從而減少H2O2刺激引起的細(xì)胞凋亡，其保護(hù)機(jī)制可能與參與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)信號(hào)通路MEK/ERK1/2和抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧生成有關(guān)。

丹酚酸B； 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞； 氧化性應(yīng)激； 活性氧簇； 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2

骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)作為成體干細(xì)胞的一種，獲取簡單，擴(kuò)增容易，同時(shí)具有自我更新和多向分化潛能，更重要的是其移植后能夠逃避宿主免疫監(jiān)視，并且分泌治療性物質(zhì)起到修復(fù)和替代受損的神經(jīng)組織的作用。因此，干細(xì)胞治療為脊髓和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病帶來了希望[1]。相對(duì)于其它類型的干細(xì)胞而言，BMSCs還具有獲取方便，擴(kuò)增容易，遺傳背景穩(wěn)定，免疫原性低等優(yōu)勢(shì)。然而，BMSCs治療的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用遭遇瓶頸。移植細(xì)胞如何在局部惡劣的微環(huán)境中存活及定向分化等關(guān)鍵問題尚待解決[2,3]。已有研究證明丹酚碳B(salvianolic acid B,Sal B)具有很強(qiáng)的抗氧化作用和明顯的抗炎作用，為了更好地闡明Sal B對(duì)移植BMSCs的保護(hù)作用及其機(jī)制，為Sal B的進(jìn)一步應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本研究擬通過過氧化氫刺激細(xì)胞模擬體內(nèi)損傷局部微環(huán)境中氧化應(yīng)激誘導(dǎo)BMSCs凋亡，觀察Sal B處理對(duì)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的BMSCs凋亡的影響并進(jìn)一步探討其可能的保護(hù)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,Hyclone);Hoechst 33342和AnnexinV-FITC/PI試劑盒購于晶美生物工程有限公司。

2方法

2.1大鼠BMSCs的分離和培養(yǎng) 取60-80 g 的雌性SD 大鼠,斷頸處死,無菌條件下取雙側(cè)股骨, PBS液反復(fù)沖洗骨髓腔至變白。將沖洗液收集于離心管中, 1 000 r/min離心5 min, 加入 DMEM/F12培養(yǎng)液5-6 mL。重懸細(xì)胞于25 cm2培養(yǎng)瓶中, 37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)。每3 d換液1次,去除未貼壁細(xì)胞。每天在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長情況。待貼壁細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí),用2.5 g/L胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞, 1∶2傳代，本實(shí)驗(yàn)均選用第4代細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)做流式表面標(biāo)志鑒定。

① 探討不同濃度Sal B對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下BMSCs活性及凋亡的影響 細(xì)胞分別被暴露于0、1、10、100 μmol/L Sal B及500 μmol/L H2O224 h。

② 探討Sal B對(duì)p-ERK1/2表達(dá)的影響 細(xì)胞分3組，分別用10 μmol/L Sal B 和(或)500 μmol/L H2O2處理，在15 min、30 min、60 min、120 min 4個(gè)時(shí)點(diǎn)取蛋白樣品。

2.2MTT檢測H2O2處理對(duì)BMSCs活性的影響 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以5×105細(xì)胞接種于96孔板，100 μL/well。在37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)過夜后，按實(shí)驗(yàn)要求給予不同處理，分別加入500 μmol/L H2O2處理24 h后，每組設(shè)8個(gè)平行孔。處理完畢后，每孔加5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液，加DMSO含0.04 mol/L HCl 100 μL/well，待其完全溶解后，用酶聯(lián)免疫儀在波長570 nm處讀取吸光度(A)。設(shè)定正常對(duì)照組MTT存活率為100%，其余各組的MTT存活率按公式：MTT存活率=(實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值)×100%。

2.3Hoechst 33342染色 將BMSCs接種在6孔板內(nèi)的蓋玻片上，各實(shí)驗(yàn)組按要求給予不同處理因素作用一定時(shí)間后，加入新鮮配制的40 g/L多聚甲醛于4 ℃固定細(xì)胞10 min,再加5 g/L Hoechst 33342染色10 min，PBS液洗后，用封片液封片后熒光顯微鏡觀察、攝片。正常細(xì)胞核出現(xiàn)均勻的強(qiáng)度熒光；細(xì)胞核如呈濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光，記為凋亡的細(xì)胞。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測Sal B對(duì)BMSCs凋亡的影響 常規(guī)消化BMSCs, 調(diào)整細(xì)胞濃度至4×108cells/L, 接種于6孔培養(yǎng)板, 3 mL/well, 培養(yǎng)過夜后, 吸出培液, 常規(guī)消化BMSCs, 分別離心, 棄上清。 用4 ℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞1次, 分別用100 μL結(jié)合緩沖液(1∶4稀釋)重新懸浮細(xì)胞, 按試劑盒說明加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和10 μL 20 mg/L碘化丙啶溶液, 混勻, 置于室溫避光孵育15 min, 流式細(xì)胞儀(flow cytometry， FCM)分析凋亡情況。

2.5流式細(xì)胞儀檢測活性氧簇(reactive oxygen species,ROS) 胰酶消化成單細(xì)胞懸液;吸取500 μL細(xì)胞懸液，加入1 mmol/L DCFH-DA 5 μL，使DCFH-DA終濃度為10 μmol/L，置于37 ℃避光孵育30 min;孵育結(jié)束后，PBS洗滌細(xì)胞2次去除可能的細(xì)胞外熒光物質(zhì);各實(shí)驗(yàn)組按要求給予不同的處理因素5 min后，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧。

3Westernblotting檢測p-ERK1/2蛋白表達(dá)

細(xì)胞培養(yǎng)至80% 左右密度時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組按要求給予不同處理因素作用一定時(shí)間后，加入400μL裂解液提取蛋白電泳轉(zhuǎn)膜后，加入按1∶1 000稀釋的p-ERK1/2 Ⅰ 抗，滴加過氧化物酶標(biāo)記 Ⅱ 抗后ECL顯色。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1不同濃度SalB對(duì)H2O2引起B(yǎng)MSCs活性下降的影響

500 μmol/L H2O2刺激24 h BMSCs活性下降為53.60%±4.21%，而 Sal B共處理對(duì)H2O2引起的細(xì)胞活性的降低有抵抗作用，其中10 μmol/L和100 μmol/L效果明顯，細(xì)胞活性分別上升至 85.33%±9.08%和75.78%±6.28%,見圖1。

圖1MTT法檢測SalB對(duì)細(xì)胞活性的影響

2SalB對(duì)H2O2誘導(dǎo)BMSCs凋亡的影響

2.1Hoechst熒光染色后，在熒光顯微鏡下觀察到

正常對(duì)照組BMSCs染色質(zhì)分布均勻，為彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光；陽性對(duì)照組及1 μmol/L Sal B處理組細(xì)胞核呈濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光； 10 μmol/L Sal B組和100 μmol/L Sal B組細(xì)胞核呈濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的凋亡細(xì)胞較陽性對(duì)照組明顯減少，P<0.05,見圖2。

2.2Annexin V/PI 雙染色法顯示Sal B處理可以對(duì)抗高濃度H2O2誘導(dǎo)的BMSCs凋亡,正常對(duì)照組BMSCs的凋亡率為3.15%±1.31%；500 μmol/L H2O2作用BMSCs 24 h，凋亡率增加到36.90%±8.37%,P<0.01。而1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L Sal B處理后凋亡率分別為35.93%±5.57%、14.27%±6.12%和27.17%±2.44%?？梢?，10 μmol/L和100 μmol/L Sal B可明顯降低500 μmol/L H2O2引起的BMSCs凋亡，P<0.01，見圖3。

3SalB處理對(duì)BMSCs胞內(nèi)活性氧生成的影響

正常組細(xì)胞的DCF陽性細(xì)胞率為28.7%±8.1%，經(jīng)500 μmol/L H2O2刺激5 min后，陽性細(xì)胞數(shù)急劇上升，高達(dá)86.9%±12.4%。而10 μmol/L Sal B處理組的上升不明顯，僅有42.1%±10.8%。由此可見，Sal B處理可以減少細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成,見圖4。

圖2Hoechst染色法檢測細(xì)胞凋亡率

圖3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

圖4DCF熒光染色檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧生成

4p-ERK1/2的表達(dá)

BMSCs經(jīng)500 μmol/L H2O2刺激，最早在15 min即可觀察到p-ERK1/2表達(dá)的上升，而這種上升持續(xù)至120 min。10 μmol/L Sal B處理可以有效抑制H2O2引起的p-ERK1/2 激活。同時(shí)Sal B可以降低細(xì)胞基礎(chǔ)的p-ERK1/2表達(dá)，見圖5。

討 論

ROS在氧化應(yīng)激狀態(tài)下一方面可以通過細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，抑制蛋白質(zhì)功能，破壞核酸和染色體等方式損傷細(xì)胞；另一方面ROS亦可作為第二信使，激活多種氧敏感的信號(hào)分子，調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)，繼而調(diào)控多種生理和病理過程，在細(xì)胞和組織和器官的發(fā)育和生長過程中發(fā)揮重要的作用[4-6]。BMSCs是一類存在于骨髓網(wǎng)狀間質(zhì)內(nèi)的非造血干細(xì)胞，已被廣泛應(yīng)用到臨床骨損傷、缺血缺氧性神經(jīng)元細(xì)胞和心肌細(xì)胞損傷的修復(fù)及治療。但由于組織在缺血缺氧性損傷和缺血再灌注過程中，細(xì)胞內(nèi)ROS清除系統(tǒng)功能降低，生成系統(tǒng)活性增強(qiáng)，引起ROS大量產(chǎn)生和堆積，而損傷局部不斷聚集的ROS不僅導(dǎo)致了組織細(xì)胞的損傷，也阻礙了移植BMSCs的遷移、分化，甚至直接導(dǎo)致了它們的凋亡或壞死，從而減少了它們?cè)趽p傷局部的存活數(shù)量，從根本上限制了它們?cè)诮M織修復(fù)中的應(yīng)用。因此，如果能夠采用一定的措施降低損傷局部的氧化應(yīng)激水平或者提高細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力就可以很好地降低移植細(xì)胞的丟失率，收到更為理想的治療效果。

Sal B具有很強(qiáng)的抗氧化作用，可以清除超氧陰離子和自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，其抗氧化作用高于維生素C、維生素E以及銀杏提取物(EGb761)，是目前己知的抗氧化作用最強(qiáng)的天然產(chǎn)物之一[7]。既往的研究顯示Sal B能夠通過降低炎癥因子刺激下血管內(nèi)皮細(xì)胞滲通性、減少VCAM-1和ICAM-1等細(xì)胞黏附因子的表達(dá)、抑制血小板的凝集、增加纖維蛋白溶解等多種機(jī)制治療缺血再灌注心肌損傷、急性心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病[8，9]。同時(shí)也有研究表明，Sal B可以抑制肝星形細(xì)胞的激活，減少膠原纖維的合成對(duì)治療肝硬化有較好療效[10，11]。而最近一些研究則發(fā)現(xiàn)Sal B對(duì)小鼠缺血再灌注引起的腦損傷有保護(hù)作用。靜脈注射Sal B可以減少缺血腦組織的缺血體積，降低腦組織中的MDA含量[12]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Sal B對(duì)腦缺血再灌注引起的記憶功能礙有明顯改善作用。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Sal B可以減少氧化應(yīng)激、Aβ等刺激因素引起的大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[12，13]。本課題組曾在2007年首創(chuàng)性地將Sal B應(yīng)用于脊髓損傷的治療研究[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Sal B和BMSCs的聯(lián)合應(yīng)用可以促進(jìn)移植BMSCs的存活，更好地促進(jìn)脊髓損傷大鼠的后肢功能恢復(fù);在體外還觀察到Sal B可以有效保護(hù)BMSCs免受炎癥因子TNF-α刺激引起的損傷。以上一系列研究資料提示了Sal B增強(qiáng)BMSCs對(duì)有害刺激的防御能力，提高細(xì)胞移植成活率的可能性。本實(shí)驗(yàn)首先觀察了不同濃度Sal B對(duì)500 μmol/L H2O2引起的BMSCs細(xì)胞活性下降和細(xì)胞凋亡數(shù)目增加效應(yīng)的影響。結(jié)果顯示500 μmol/L H2O2的刺激下，BMSCs細(xì)胞活性明顯下降，細(xì)胞凋亡數(shù)目增加。而Sal B處理不僅可以提高氧化應(yīng)激狀態(tài)下BMSCs的細(xì)胞活性，也減少了500 μmol/L H2O2引起的細(xì)胞凋亡。

圖5不同處理p-ERK1/2蛋白水平的時(shí)程變化

氧化應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活。這些信號(hào)通路之間的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，它們的激活對(duì)于細(xì)胞存活或死亡起著至關(guān)重要的作用。MEK/ERK是其中一條研究較多的通路。最早的研究資料表明MEK/ERK信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的生長、存活和分化[15,16]。在損傷因素刺激下p-ERK1/2的激活有助于機(jī)體調(diào)動(dòng)體內(nèi)的抗凋亡機(jī)制，抵抗有害因素的損傷，提高機(jī)體的適應(yīng)能力，提高細(xì)胞存活。但隨著研究的進(jìn)一步深入，F(xiàn)ischer等[17]則持相反意見，他們指出p-ERK1/2的激活是一定刺激條件下引發(fā)細(xì)胞凋亡的必要步驟，扮演著凋亡主要執(zhí)行者caspase-3上游基因的角色。對(duì)于這樣矛盾的資料，Liu等[18]認(rèn)為這是由于p-ERK1/2基因功能復(fù)雜性所導(dǎo)致的，p-ERK1/2究竟促進(jìn)凋亡還是抑制凋亡應(yīng)該取決于不同的細(xì)胞 。而在BMSCs，觀察到p-ERK1/2促進(jìn)凋亡，而Sal B的應(yīng)用可以有效抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)下ERK1/2的激活。實(shí)驗(yàn)觀察到Sal B抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的BMSCs凋亡與MEK/ERK通路相關(guān)，這與早前Liu等[18]在rCMECs上觀察到的相一致。

存在問題：由于實(shí)驗(yàn)條件制約，本實(shí)驗(yàn)主要把研究重點(diǎn)集中放在MEK/ERK信號(hào)通路在Sal B抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)BMSCs凋亡的作用上，沒有全面探討其它信號(hào)通路如PI3K等在這個(gè)過程中的作用，在以后的實(shí)驗(yàn)里應(yīng)該繼續(xù)探討其它凋亡相關(guān)信號(hào)通路在Sal B抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)BMSCs凋亡效應(yīng)中的作用以進(jìn)一步明確Sal B的作用機(jī)制，為這種中藥單體的臨床應(yīng)用提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本室已在此工作基礎(chǔ)上開展Sal B促進(jìn)脊髓損傷康復(fù)的研究和基因修飾BMSCs治療腦缺血損傷的研究[19，20]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Sal B可以增強(qiáng)BMSCs抗氧化應(yīng)激能力從而減少H2O2刺激引起的細(xì)胞凋亡，其保護(hù)機(jī)制可能與Sal B直接降低氧化應(yīng)激情況下細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成水平，抑制前凋亡基因p-ERK1/2的激活有關(guān)。這為Sal B這種中藥單體的臨床應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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SalvianolicacidBreducesapoptosisofbonemarrowstemcellsinducedbyhydrogenperoxide

LU Bi-yan1, TONG Xiu-zhen2, DENG Yu-bin1, WU Hong-fu1, HOU Jing-yi1

(1DepartmentofPathophysiology,ZhongshanSchoolofMedicine,2DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:dengyub@mail.sysu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of salvianolic acid B (Sal B) on apoptosis of rat bone mesenchymal stem cells(BMSCs) induced by hydrogen peroxide(H2O2).METHODSBMSCs were incubated with Sal B at the concentration of 1, 10 or 100 μmol/L while treated with lethal concentration of H2O2(500 μmol/L). The effect of Sal B at different concentrations on the viability of BMSCs was detected by MTT. Flow cytometry were used to determine the protective role of Sal B in apoptosis of BMSCs. The changes of chromatin distribution in BMSCs were observed by Hoechst 33342 staining. The expression of p-ERK1/2 was detected by Western blotting.RESULTSSal B protected the BMSCs against H2O2as the cell viability was increased from (53.60±4.21)% to (85.33±9.08)% or (75.78±6.28)% in a dose-dependent manner. After exposed to H2O2, about 50%-65% BMSCs displayed apoptotic morphology. Treatment with Sal B at the concentrations of 10 and 100 μmol/L reduced the cytotoxic effect of H2O2on BMSCs to about 32% and 47%, respectively. The results of flow cytometric analysis confirmed the cytoprotective effect of Sal B. This protective effect was concomitant with significant reduction of ROS generation. Moreover, H2O2time-dependently induced a pronounced increase in ERK1/2 phosphorylation,which was effectively inhibited by Sal B.CONCLUSIONSal B protects BMSCs against H2O2-induced apoptosis. Sal B may exert its protective effect on BMSCs by triggering intracellular anti-apoptosis mechanism as well as reducing the oxidative stress.

Salvianolic acid B; Bone mesenchymat stem cells; Oxidative stress; Reactive oxygen species; Extracellular signal-regulated kinase 1/2

R363

A

1000-4718(2011)03-0475-06

2010-09-16

2010-12-15

廣東省中醫(yī)藥局資助項(xiàng)目(No.2008078)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.C030307);中山大學(xué)國家大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(No.200834；No.200837)

△通訊作者 Tel:020-87331698;E-mail:dengyub@mail.sysu.edu.cn

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.011