通心絡對同型半胱氨酸損傷的內皮細胞的基因表達譜的影響*

陳燕銘， 吳 琳， 劉 勇， 周 彬， 王 敏， 劉定輝， 廖火城， 吳偉康， 吳以嶺， 錢孝賢,△

(中山大學附屬第三醫院1內分泌科，2心血管內科，3中山大學中西醫結合研究所， 廣東 廣州 510630；4河北省中西醫結合醫藥研究院，河北 石家莊 050035)

通心絡對同型半胱氨酸損傷的內皮細胞的基因表達譜的影響*

陳燕銘1， 吳 琳2， 劉 勇2， 周 彬2， 王 敏2， 劉定輝2， 廖火城2， 吳偉康3， 吳以嶺4， 錢孝賢2,3△

(中山大學附屬第三醫院1內分泌科，2心血管內科，3中山大學中西醫結合研究所， 廣東 廣州 510630；4河北省中西醫結合醫藥研究院，河北 石家莊 050035)

目的探討通心絡對同型半胱氨酸(Hcy)損傷的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的基因表達譜的影響。方法原代培養的HUVECs，隨機分為對照組、Hcy組和通心絡組，提取總RNA并純化，反轉錄合成熒光分子(Cy3/Cy5)標記的cDNA探針，采用高通量Affymetric人類全基因組寡核苷酸微陣列芯片(含47 000個基因或基因片段)雜交，雜交信號經掃描和數字化處理，通過生物信息學數據分析推測通心絡對同型半胱氨酸損傷的HUVECs細胞功能的影響以及可能的信號通路。結果與對照組相比，Hcy組有4 343個基因表達上調，316個基因表達下調；與Hcy組相比，通心絡組有3 409個基因表達上調，121個基因表達下調。這些共同的差異基因生物功能涉及轉錄因子調控、激酶、細胞骨架與蛋白合成、轉運功能、細胞因子、細胞-細胞受體相互作用和細胞黏附因子等。參與的信號通路主要是與血管新生、凋亡、氧化應激、凝血纖溶和炎癥等相關的信號通路,如mTOR信號通路、MAPK信號通路和Toll樣受體信號通路。結論通心絡能導致同型半胱氨酸損傷內皮細胞基因表達譜的改變，這些基因改變可能參與了細胞凋亡、氧化應激和凝血纖溶等過程。

人臍靜脈內皮細胞； 高半胱氨酸； 通心絡； 基因芯片； 基因表達譜

通心絡膠囊是根據絡病理論研制的復方制劑，近年來大量臨床和動物實驗研究表明，通心絡可改善內皮功能、抗氧自由基、抗動脈粥樣硬化，減輕心肌缺血-再灌注損傷等作用[1,2]。其中，對內皮細胞功能的保護作用是通心絡的心腦血管保護作用的重要途徑之一。內皮細胞不僅具有屏障作用，而且具有內分泌、調控血管舒縮等復雜的生理作用。同型半胱氨酸是近年來證實的心血管疾病獨立危險因子[3]，研究證明血管內皮是同型半胱氨酸作用的重要靶器官。目前，通心絡對同型半胱氨酸損傷的內皮細胞保護作用機制尚不明了。本實驗采用高通量表達譜基因芯片-人類全基因組寡核苷酸微陣列芯片[4](CapitalBio, China)對同型半胱氨酸損傷的內皮細胞及通心絡對內皮細胞的影響的可能基因組mRNA水平進行全基因組篩查，并采用生物信息學方法對結果進行分析，旨在揭示通心絡對內皮細胞作用的分子機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1芯片 全基因組寡核苷酸芯片HG-U133 Affymetric plus 2.0，包含54 614個探針組，分析47 000個轉錄體和變異體，其中包括了可能的38 500個已知基因。

1.2儀器與試劑 通心絡超微粉膠囊由石家莊以嶺藥業股份有限公司提供。Poly-A RNA Control Kit，Hybridization Control Kit，R-phycoerythrin Streptavidin，Hybridization Oven 640，Fluidics Station 450，GeneChip Scanner 3000均為Affymetrix產品。

1.3通心絡超微粉溶液的制備 通心絡超微粉溶液的制備用M199培養液溶解通心絡超微粉，配置為50 g/L原液，室溫條件下，充分振蕩30 min，超聲溶解1 min，1 000 r/min離心10 min，取上清用于細胞培養。

2方法

2.1人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)原代培養及鑒定 健康新生兒臍帶取自中山大學附屬第三醫院婦產科；參考Jaffe改良法，無菌收集新生兒臍帶，PBS緩沖液反復沖洗靜脈腔后灌注0.1%膠原酶消化30 min，含10%血清的M199培養基終止消化，消化液1 000 r/min離心5 min后加入培養液重懸細胞，計數細胞數量，于37 ℃、5% CO2培養箱內培養。待細胞貼壁并85%融合后，用0.05%胰酶消化傳代，選擇生長良好的第3-5代用于實驗。HUVECs經細胞形態學鑒定，而且流式細胞術CD34檢測陽性證實。

2.2實驗分組 細胞同步化后，分為對照組(培養液不加干擾因素)、同型半胱氨酸 (homocysteine,Hcy)組(0.5 mol/L)和通心絡組(Hcy 0.5 mol/L+通心絡 5 g/L)，上述各組藥物干預48 h。

2.3樣品RNA的準備 干預結束,吸干培養液，洗滌細胞后用Trizol(Invitrogen)一步法提取細胞中的總RNA，采用RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen)對總RNA進行純化。采用分光光度計分析RNA濃度和純度。

2.4熒光標記和基因芯片雜交 按CapitalBio公司實驗操作流程進行，將Cy3-dCTP和Cy5-dCTP(GE Healthcare) 分別標記不同來源細胞總RNA 的轉錄產物，標記產物純化后于Hybridization Oven 640中雜交。雜交結束后在Fluidics Station 450洗脫和染色。

2.5掃描、圖像的采集與數據分析 采用GeneChip Scanner 3000進行掃描，用GeneChip Operating software (GCOS 1.4)分析軟件對芯片圖像進行分析，把圖像信號轉化為數字信號；然后dChip軟件做校正和歸一化處理。

2.6表達基因的篩選和差異基因的信息學分析 刪除熒光信號弱的基因(<1 500)，以及芯片上的陰性對照、內標、外標等冗余的數據，2張雜交膜中相同點的信號強度進行比較得出該基因的信號比值(Cy5/Cy3)，以>2或<0.5倍標準篩選差異表達基因，信號比值>2表示基因上調，而<0.5則表示基因下調。在進行生物信息學分析時，把篩選出的差異表達基因對照KEGG(www.genome.jp/kegg/)和BioCarta(www.biocarta.com)數據庫進行途徑分析(pathway analysis)。

2.7驗證芯片結果 我們挑選4個差異表達基因做實時定量RT-PCR，操作按試劑說明書和儀器操作規程。在ABI Prism 7000熒光定量PCR分析儀進行擴增及定量分析。本實驗設定β-actin為管家基因。引物序列見表1。

表1 實時定量PCR的基因序列

3統計學處理

所有基因表達數據的分析均采用Affymetrix公司的GCOS 1.2軟件對獲得的各雜交點的信號值進行數據處理和分析。將有顯著表達差異的基因，上傳到Affymetrix分析中心MAS平臺 (Molecule Annotation System)(http://bioinfo. capitalbio.com/mas/)進行資料分析，獲取每個探針的信息。利用KEGG pathway和Gene Ontology (Go) (http://www.Geneontology.org)分析差異基因在信號通路上的富集程度及分子功能和生物學過程的分類。熒光定量PCR反應結束后由計算機自動計算定量結果，用△△Ct方法進行計算RNA表達量。利用SPSS 13.0 配對樣本t檢驗比較基因芯片實驗和定量PCR實驗目的基因表達差異統計。將目的基因的相對差異表達水平與Affymetrix芯片實驗結果進行比較，判定兩者是否一致。

結 果

1樣本和芯片質量控制結果

實驗中提取的總RNA 所進行的凝膠電泳及分光光度計分析，證實獲得了高質量的總RNA。OligoB2、Poly-A controls、hybridization controls等陽性對照信號正常；看家基因信號值及3’/5’比值正常；平均背景值與噪音值較低；present percent數值正常；證實各質控指標符合要求。

2差異表達基因

選擇表達差異≥2倍為表達上調基因，而≤0.50倍為表達下調基因。各基因的雜交信號強度分布見圖1，該圖中每一個數據點代表芯片上一個基因點的雜交信號，X軸、Y軸分別代表Cy3和Cy5的信號強度，大部分集中在一個接近45°的對角線周圍的紅點，代表信號差異在0.5-2.0的倍區間，基本屬于非差異性表達基因，而一些黃點分布在45°的對角線外，這些點可能是差異表達基因。

分析表明，相比Hcy組，對照組共有4 659個基因出現表達差異，其中，4 343個基因表達上調，316個基因表達下調，部分差異表達基因見表2。對比Hcy組，TXL組共有3 530個基因出現表達差異，其中3 409個基因表達上調，121個基因表達下調，部分差異表達基因見表3。比較TXL組和正常對照組，僅有59個基因出現表達差異，其中，29個基因表達上調，30個基因表達下調。

Figure 1. Scatter spots of hybridization signals on gene chip. A: Hcyvscontrol; B: HcyvsTongxinluo; C: Tongxinluovscontrol.

圖1表達譜芯片雜交信號強度雙對散點圖

表2 Hcy組vs對照組的差異基因

Cy5/Cy3 ratio>2:up-regulative gene; Cy5/Cy3 ratio<0.5:down-regulative gene.

表3 Hcy組 vs 通心絡組的差異基因

Cy5/Cy3 ratio>2:up-regulative gene; Cy5/Cy3 ratio<0.5:down-regulative gene.

3通路分析

通過比對KEGG和BioCarta 數據庫進行差異基因的途徑分析表明，2張芯片(Hcyvscontrol; HcyvsTXL)共同差異基因的可能相關途徑列于表4中。其中，影響較大的是凋亡(apoptosis)信號通路、促絲裂原活化蛋白激酶(MAPK) 信號途徑和mROT信號通路等，包括細胞-細胞受體相互作用、細胞黏附分子、脂肪細胞因子信號途徑、氧化應激等與內皮細胞增殖、凋亡、物質代謝和氧化應激等的途徑均受到影響。部分信號通路見表4。

4實時定量RT-PCR驗證基因芯片結果

基因芯片結果與定量RT-PCR的改變倍數(表5)雖然有差異，變化趨勢一致，且差異無顯著(P>0.05，n=4)，證明基因芯片結果可靠。

表4 差異基因的信號通路

表5實時定量RT-PCR與基因芯片結果比較

Table 5. Testing result comparison of real-time RT-PCR and gene chip(n=4)

GenesGenechipReal-timeRT-PCRHcyvscontrolHcyvsTXLHcyvscontrolHcyvsTXLPRKACB3.012.762.512.36FAS4.123.575.214.87CASP82.282.213.783.57MAP2K42.872.754.545.21

討 論

高同型半胱氨酸血癥是動脈粥樣硬化的獨立危險因子之一，其在心血管疾病的發生發展中的作用尚未明了。其中血管內皮細胞是同型半胱氨酸的重要靶器官。通心絡膠囊是運用中醫絡病理論研制的復方中藥制劑。目前針對同型半胱氨酸所致動脈粥樣硬化的致病機制研究大部分仍局限在少數幾個基因、蛋白的比較分析范疇內，對通心絡心血管保護作用的探索也較局限，一般僅在通路水平上進行探討[5]，這樣所提供的信息單一，難以較全面地認識相關基因的表達狀況。大量研究證明，基因和蛋白質較少單獨起作用，它們往往通過復雜的網絡交互作用共同影響生物系統的功能，這些功能高度相關的基因構成基因群。動脈粥樣硬化的發生發展過程中存在著極其復雜的調控網絡[6]基因芯片是一項高通量篩選技術，具有高通量、自動化、高效率、平行等優點，通過少量標本的分析，能夠全面地反映疾病基因表達譜。

GO是Gene Ontology(GO)Consortium(http://www.geneontology.org/)制定的動態受控性詞匯表[7]，GO分析是將差異基因進行分類，從中發現不同樣本的主要差別。GO將基因分為3大類：分子功能(molecular function)、生物學過程(biological process)和細胞成分(cellular component)。在GO分析中，我們選擇可信度P=0.02，所選擇的類別中2個組差別明顯。(1)在生物學過程中，生物調節相關的差異表達基因主要集中在細胞周期調節、細胞增殖調節、凋亡調節、細胞活性、細胞黏附及細胞定位和功能調控這些功能群，這提示Hcy及通心絡參與了細胞周期的調節、增殖和凋亡等關系細胞損傷、修復的生理過程；(2)在分子功能中，差異基因主要集中在催化活性、結合作用、轉運活性、信號轉導、酶調節活性、分子轉導活性、轉錄調節活性、電子載體活性及結構蛋白活性等，這些生物功能的改變與細胞增殖速度、分裂速度、細胞修復的核酸復制及較復雜的物質轉運過程相關；(3)在細胞成分中，大部分集中在細胞器、蛋白結合物及大分子復合物中，其次是膜內腔、胞外區等，提示Hcy可能因對細胞損傷導致部分細胞器活性提高甚至出現細胞器形態學改變，通心絡可以部分改善Hcy對細胞成分的影響。按照基因功能分類的GO標準，我們對差異基因進行功能分析，發現這些基因是涉及凋亡相關、信號轉導相關、轉錄相關、免疫相關、生長分化相關和細胞周期相關等不同層次、不同功能的基因，很多基因都參與多種生物學過程，具有多種分子功能，形成網絡，因此難以單純地歸為某一類。

KEGG-日本基因和基因組京都百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是系統分析基因功能、聯系基因組信息和功能信息的知識庫[8]，通過更高級的KEGG PATHWAY數據庫中，可以詳細了解細胞生化過程如代謝、膜轉運、信號傳遞、細胞周期，還包括同系保守的子通路等信息。經KEGG數據分析，Hcy組對比正常組的差異基因中共有81組差異的信號通路，其中38個信號通路差異非常顯著(P<0.01)。Hcy組對比通心絡組的差異基因中，共有63組差異的信號通路，其中41個信號通路差異非常顯著(P<0.01)。將這2批信號通路進行比對，發現共有26組信號通路是共同擁有的，其中包括凋亡通路、MAPK通路、JAK-STAT通路、mTOR通路、VEGF通路及Toll樣受體通路等與氧化應激、炎癥及免疫反應、凝血纖溶系統等病理生理過程相關的重要信號通路，同時提示通心絡可能通過上述信號通路對同型半胱氨酸損傷內皮細胞進行保護，絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)是細胞內促增殖和傳遞應激信號的轉導通路的核心環節，該家族包括ERK 、JNK、p38等亞族。MAPK可通過磷酸化轉錄因子、細胞骨架相關蛋白、酶類等底物參與介導生長、發育、分裂、分化、死亡及細胞間的功能同步等細胞生理過程。MAPK磷酸酶激活多種轉錄因子，影響基因表達，調節細胞增殖。鑒于MAPK與氧化應激、炎癥密切相關，因此在動脈粥樣硬化的發生過程中起重要作用。研究證明，通心絡可通過激活JNK通路[9]、上調NOS-NO通路[10]改善內皮細胞功能。本研究發現MAPK通路中3個亞族中的多個相關基因如PPP3CA、MAP3K7、MAP2K1IP1、RAPGEF2、ZAK表達均有顯著差異，提示Hcy與氧化應激、炎癥過程密切相關。

本研究通過對同型半胱氨酸損傷內皮細胞的基因表達譜的研究，發現通心絡能改善同型半胱氨酸損傷內皮細胞基因表達譜，這些基因改變可能參于了細胞凋亡、氧化應激和凝血纖溶等過程，今后可進一步研究通心絡作用的信號通路。

[1] Cheng YT, Yang YJ, Zhang HT, et al. Pretreatment with Tongxinluo protects porcine myocardium from ischaemia/reperfusion injury through a nitric oxide related mechanism [J]. Chin Med J(Engl), 2009, 122(13): 1529-1538.

[2] 錢孝賢，陳燕銘，劉 勇，等.通心絡治療穩定型心絞痛的臨床療效及對內皮功能的影響[J].中國病理生理雜志，2006，22(9)：1698-1701.

[3] Abdulle AM, Pathan JY, Moussa N, et al. Association between homocysteine and endothelial dysfunction markers in stroke disease[J]. Nutr Neurosci, 2010, 13(1): 2-6.

[4] Folkersen L, Kurtovic S, Razuvaev A, et al. Endogenous control genes in complex vascular tissue samples [J]. BMC Genomics, 2009, 10(516):1-8.

[5] Liang JQ, Xu HB, Wu YL, et al. Effect of serum from overfatigue rats on JNK/c-Jun/HO-1 pathway in human umbilical vein endothelial cells and the intervening effect of Tongxinluo superfine powder [J]. Chin J Integr Med, 2009,15(2):121-127.

[6] Mun GI, Lee SJ, An SM, et al. Differential gene expression in young and senescent endothelial cells under static and laminar shear stress conditions [J].Free Radic Biol Med, 2009, 47(3): 291-299.

[7] Xu T, Gu J, Zhou Y, et al. Improving detection of differentially expressed gene sets by applying cluster enrichment analysis to gene ontology [J]. BMC Bioinformatics, 2009, 10: 240.

[8] Yu J, Yin P, Liu F, et al. Effect of heat stress on the porcine small intestine: A morphological and gene expression study [J].Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol, 2010, 156(1): 119-128.

[9] Liang JQ, Xu HB, Wu YL, et al. Effect of serum from overfatigue rats on JNK/c-Jun/HO-1 pathway in human umbilical vein endothelial cells and the intervening effect of Tongxinluo superfine powder [J]. Chin J Integr Med, 2009, 15(2): 121-127.

[10]馬琦琳, 孫 明, 楊天侖,等. 通心絡對血管緊張素II誘導的血管內皮細胞活力及組織因子的影響[J].中南大學學報(醫學版), 2007, 32(3): 485-489.

EffectofTongxinluoongeneexpressionprofilesofendothelialcellstreatedwithhomocysteine

CHEN Yan-ming1, WU Lin2, LIU Yong2, ZHOU Bin2, WANG Min2, LIU Ding-hui2, LIAO Huo-cheng2, WU Wei-kang3, WU Yi-ling4, QIAN Xiao-xian2,3

(1DepartmentofEndocrinology，2DepartmentofCardiology，3InstituteofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicineofSunYat-senUniversity,ThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;4TheIntegrationofTraditionalandWesternMedicalResearchAcademyofHebeiProvince,Shijiazhuang050035,China.E-mail:xiaoxianq@qq.com)

AIM: To explore the effects of Tongxinluo on the gene expression profiles of homocysteine-treated human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).METHODSThe cell injury model was established by treating the HUVECs with homocysteine. Cultured HUVECs were divided into 3 groups: control group (without any treatment), homocysteine group (treated with homocysteine at the concentration of 0.5 mol/L) and Tongxinluo group (trated with homocysteine+Tongxinluo). The total RNA isolated from the cells with Trizol method was purified and reversely transcribed for synthesizing Cy3/Cy5 labeled cDNA probe. The probe was hybridized with microarray-based Affymetric high throughput gene expression profile (47 000 genes or gene fragments) to screen the differentially expressed genes among the cells with different treatment. The effect of Tongxinluo on the biological function of HUVECs and the possible signal pathway were analyzed.RESULTSCompared with the control cells, 4 659 (9.91%) genes were detected to have marked changes with 4 343 up-regulated and 316 down-regulated expression in homocysteine treated cells. Compared with the cells treated with homocysteine, 3 530 (7.51%) genes were detected to have marked changes with 3 409 up-regulated and 121 down-regulated expression in the cells treated with homocysteine+Tongxinluo. These genes were involved in transcription activators, cytoskeleton and protein biosynthesis, transport function, cytokines, cell adhesion molecule and metabolism. Signal pathway analysis indicated that Tongxinluo played roles in certain pathways related to vascular proliferation, apoptosis, oxide stress, coagulation, fibrinolysis and inflammation, such as mTOR, MAPK and Toll-like receptor signaling pathways.CONCLUSIONTongxinluo alters the gene expression profiles of HUVECs injury induced by homocysteine, resulting in the change and modification of cell apoptosis, oxide stress, coagulation and fibrinolysis.

Human umbilical vein endothelial cells; Homocysteine; Tongxinluo; Gene chip; Gene expression profile

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.008

1000-4718(2011)01-0042-06

2010-06-24

2010-11-17

國家重點基礎研究發展規劃973資助項目(No.2005CB523305);廣東省自然科學基金資助項目(No.8151008901000209)；廣東省科技計劃資助項目(No.2007B060401024)

△通訊作者 Tel: 020-85252168; E-mail：xiaoxianq@qq.com