不同周齡自發性高血壓大鼠血管內皮功能及氧化應激的變化研究*

李 虹, 王 蕾, 肖傳實, 楊慧宇

(山西醫科大學第二醫院心內科， 山西 太原 030001)

不同周齡自發性高血壓大鼠血管內皮功能及氧化應激的變化研究*

李 虹, 王 蕾, 肖傳實△, 楊慧宇

(山西醫科大學第二醫院心內科， 山西 太原 030001)

目的觀察不同周齡的自發性高血壓大鼠(SHR)內皮功能變化、體內的氧化應激狀態及其對血管內皮功能的影響。方法將SHR隨機分為3組：5周、16周及40周齡組，每組各15只。觀察SHR離體胸主動脈和腎動脈對乙酰膽堿(Ach)的反應性，并對其內皮功能變化進行比較，分別使用放射免疫法、硝酸還原酶法、硫代巴比妥酸比色法和5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)法檢測血中內皮素(ET)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量。結果內皮依賴性血管舒張功能隨著周齡的增加而減弱。隨著周齡的增加，血管活性物質NO/ET及氧化應激標志GSH-Px、MDA發生變化。16周及40周血清NO低于5周齡SHR[(12.84±1.58)μmol/L，(12.17±1.17)μmol/Lvs(22.64±1.69)μmol/L,P<0.01]；16周及40周ET分泌水平無明顯差別，與5周相比無顯著差別；40周MDA含量[(13.71±1.47) ng/L ] 與5周[ (7.54±1.19) ng/L ] 和16周 [ (7.94±0.83) ng/L ] 相比明顯增加(P<0.01)；而40周GSH-Px活力 [ (2 368.00±60.39)×103U/L ] 與5周[ (2 925.00±75.11)×103U/L ]和16周 [(2 976.00± 329.94)×103U/L] 相比明顯降低(P<0.01)。結論SHR存在內皮功能損傷及氧化應激的增加，隨著周齡的增加損傷加重。

自發性高血壓大鼠; 內皮功能; 氧化性應激; 高血壓

高血壓是危害人民健康最為常見的心血管疾病。其患病率隨年齡而增長。目前對非血流動力學機制內皮-一氧化氮(nitric oxide,NO)-氧化應力鏈(oxidation stress)在高血壓發生發展中的重要參與受到重視，血管內皮是一個動態的器官，其結構和功能的正常對維持血流穩態起著重要作用。在高血壓狀態下，血管內皮功能失調，內皮依賴性血管舒張功能下降。氧化應激是機體內自由基的產生和抗氧化防御之間嚴重失衡的一種病理狀態，在高血壓的發生發展中起著不可忽視的作用。有實驗研究表明，與年齡相關的自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)的主動脈抗氧化酶活性改變，提示年齡增加，抗氧化酶活性降低。在內皮功能與氧化應力關系的研究中部分動物實驗使用抗氧化劑、外源性NO供體及過氧化物歧化酶類似物治療可以阻止年齡依賴性內皮細胞凋亡且改善大鼠的內皮功能并降低血壓[1-3]。然而對于不同周齡SHR體內內皮功能變化、氧化應激狀態及其相互作用，未見相關報道。本研究主要采用離體血管環技術觀察不同周齡SHR內皮功能變化、體內氧化應激狀態及其對血管內皮功能的影響，以評價年齡對它們的影響，為進一步觀察對不同周齡SHR的藥物干預實驗提供依據。

材 料 和 方 法

1材料及試劑

1.1動物 雄性SHR 5周、16周、40周齡，重250 g，清潔級，購自四川省實驗動物檢測中心[編號為SCXK(川)2004-16]。

1.2主要試劑 NO試劑盒、內皮素(endothelin,ET)試劑盒、谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase,GHS-Px)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，胎牛血清購自上海浦東新區高橋獸醫站，臺盼藍染液購自Amresco，苯腎上腺素(phenylephrine，PE)購自上海禾豐制藥有限公司，乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)購自Sigma。

1.3主要儀器 遙感測壓監測系統(DSI)；植入子(TAllPA-CA0)(DSI)；數據接收器(PRC-1 SN6301)(DSI)；外界壓力監控器(APR-1 SN 1782)(DSI)；數據轉換器(Matrix 2261)(DSI)；數據處理軟件(Silver 4．0)(DSI)；BL-410生物信號顯示與處理系統(成都泰盟電子有限公司)。

2方法

2.1實驗分組 SHR分為3組：分別為5周齡、16周齡、40周齡，每組各15只。

2.2血壓遙感監測系統建立 SHR使用1%戊巴比妥鈉(4 mL/kg)麻醉，于腹正中線切開長約2-3 cm的切口，分離腹主動脈，用2%利多卡因沖洗血管。暫時夾閉血管，用25號針頭穿入腹主動脈并順其孔將植入子導管插入約5-6 mm(逆血流方向)，用纖維片固定導管。之后，再次用2%利多卡因沖洗血管，避免血管收縮痙攣。將腸段送回腹腔。植入子被固定在腹壁并關腹。術后大鼠單籠飼養，可以無拘束自由活動，術后7-10 d左右血壓、心率趨于穩定，將籠置于接收板上收集數據，并由信號處理器轉換后用相關軟件分析整理，監測血壓心率變化。

2.3胸主動脈條制備及方法

① 胸主動脈條制備 用1%戊巴比妥鈉，即4 mL/kg腹腔注射，麻醉動物。迅速將胸主動脈分離，清除掉脂肪和黏連的離體動脈剪成3-4 mm的血管環備用。懸掛在盛有PSS液的器官浴管中，并與張力換能器相連，浴管中持續通以95%O2、5%CO2的混合氣體。

② 方法 將血管環水平懸吊于容積為10 mL的組織浴池中，并連接在Powerlab記錄儀張力轉感器上。置于37 ℃通95%O2、5%CO2的 PSS液[含(mmol·L-1) NaCl 144, KCl 5.8, MgCl21.2, CaCl22.5, 葡萄糖11.1, HEPES 5 (pH 7.4)]中,取靜息張力2 g平衡80 min,在PE(終濃度為10-7mol·L-1)預收縮的基礎上,觀察并計算ACh(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol·L-1)誘導的最大舒張百分比，間接反映血管內皮功能。

2.4腎動脈條制備及方法

① 腎動脈條制備 用1%戊巴比妥鈉，即4 mL/kg腹腔注射，麻醉動物。立即取出腎臟浸入4 ℃的 PSS液中。先用大頭針固定腎臟于盛有 PSS 液的平皿，腎組織中動脈較韌，可用鑷子直接剝碎腎組織暴露腎動脈各級分支，沿腎動脈剝離動脈的三級分支，分離干凈周圍的組織，剪取 2 mm 左右的血管環。

② 方法 將2根直徑為 40 μm 的鎢絲穿入管腔，固定血管環在 Multi Myograph System-610M 浴漕內傳感器上，持續通以 100% O2。浴漕溫度恒定在 37 ℃，平衡 60 min 后開始實驗，平衡期間每隔 15 min 用預熱的 PSS 液(37 ℃)更換浴漕內液體1次。血管環的張力變化通過 DMT 的換能系統采集，并用 Chart 5.3 記錄在微機上。

2.6血清ET含量測定 大鼠斷頭處死后，取血2 mL加入含10%EDTA-Na230 μL，抑肽酶400 IU的冰預冷試管中，混勻，4 ℃ 3 000 r/min離心15 min，分離血漿，取上清，采用放免法測血漿ET水平。

2.7血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量測定 采用硫代巴比妥酸比色法(TBA)，嚴格按照試劑盒說明操作。

2.8血清GSH-Px活性測定 用5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)直接顯色法測定GSH-Px活性。酶活性單位：0.1 mL血漿反應5 min使反應液中GSH濃度降低1 μmol/L為1個活性單位。

3統計學處理

結 果

1不同周齡SHR動態血壓變化

從圖1A中可以直觀地看到16周SHR的24 h血壓情況，血壓呈夜間高，白天低的晝夜變化，平均動脈壓波動在(133.50±7.83)mmHg左右，脈壓約(48.78±6.42)mmHg。從圖1B中同樣可以直觀地看到40周SHR的24 h血壓情況，血壓呈夜間高，白天低的晝夜變化，平均動脈壓波動在(140.6±14.7)mmHg左右，脈壓約(50.48±4.57)mmHg。監測16周及40周SHR的24 h動態血壓，發現 40周SHR較16周SHR 24 h血壓均值高，但沒有顯著差異(P>0.05)。

圖1通過遙感測壓監測系統檢測不同周齡SHR24h動態血壓變化

2不同周齡SHR胸主動脈環、腎動脈環內皮功能的實驗研究

不同周齡SHR胸主動脈環對ACh的濃度依賴性比較：40周SHR最大內皮依賴性舒張功能與5周及16周相比明顯降低(57.49%±7.04%vs78.88%±11.04%，76.81%±3.18%，P<0.01)，5周與16周之間無明顯差異；不同周齡SHR腎動脈環對ACh的濃度依賴性比較：40周SHR最大內皮依賴性舒張功能與5周及16周相比明顯降低(17.40%±10.34%vs55.72%±9.99%，65.07%±3.46%P<0. 01)，5周與16周之間無明顯差異，見圖2A、B。

3不同周齡SHR血清NO、ET、MDA、GSH-Px含量測定

16周及40周SHR的血清NO含量[(12.84±1.58)μmol/L，(12.17±1.17)μmol/L]與5周SHR的NO含量(22.64±1.69)μmol/L相比明顯減少(P<0.01)，16周及40周NO含量無明顯差異,見表1。

5周SHR的ET含量[(147.19±13.11 ) ng/L]與16周及40周ET含量[(141.22±5.17) ng/L，(154.27±17.46) ng/L]相比無明顯差異,見表1。

40周MDA含量[(13.71±1.47) ng/L]較5周SHR的MDA[(7.54±1.19 ) ng/L]與16周[(7.94±0.83) ng/L]相比明顯增加(P<0.01)，5周及16周MDA含量無明顯差異，見表2。

圖2不同周齡SHR主動脈環和腎動脈環對ACh的濃度依賴性比較

表1不同周齡SHR血清NO、ET、MDA、GSH-Px含量測定

Index5-weekSHR16-weekSHR40-weekSHRNO(μmol/L)22.64±1.6912.84±1.58**12.17±1.17**ET(ng/L)147.19±13.11141.22±5.17154.27±17.46NO/ET(ratio)0.15380.09090.0788MDA(ng/L)7.94±0.83#7.54±1.19#13.71±1.47GSH-Px(103U/L)2925.00±75.11#2976.00±329.94#2368.00±60.39

**P<0.01vs5-week SHR;#P<0.05vs40-week SHR.

40周GSH-Px含量[(2 368.00±60.39)×103U/L]與5周SHR的GSH-Px[(2 925.00±75.11)×103U/L]和16周[(2 976.00±329.94)×103U/L]相比明顯降低(P<0.01)，5周及16周GSH-Px含量無明顯差異，見表1。

討 論

原發性高血壓的病因和發病機制與多種因素有關，其中內皮-NO-OS鏈對血壓的調節具有重要意義。自從1973年Ross等[4]首先提出動脈內膜損傷可以促進動脈粥樣硬化進程的假說后，內皮細胞損傷學說一直受到廣泛重視。新近研究表明，心血管活性物質平衡失調在原發性高血壓的發生發展中起著重要的作用。內皮源性舒張因子NO與原發性高血壓的形成有著密切的關系。本實驗觀察到16周及40周SHR的血清NO含量與5周SHR的NO含量相比明顯減少(P<0.01)，而16周及40周NO含量無明顯差異。5周SHR屬于高血壓的形成階段，而成熟期是在16周以后，在高血壓的形成階段，NO釋放減少，不隨著年齡的增加而變化。

與高血壓發病密切相關的血管活性物質還包括ET。 ET與NO構成了一對具有拮抗效應的血管活性物質。兩者合成釋放的協調是調節血管基礎張力、維持血壓穩定的最主要因素。在各種高血壓動物模型和人類原發性高血壓病人的研究中發現，血漿ET水平可表現為增高或降低[5-7]。本研究以同齡WKY大鼠為正常對照，發現SHR在高血壓發生前后其血漿ET水平顯著增高，提示SHR高血壓的形成可能與其高水平的ET含量有關，且與血壓正相關。但不同周齡的ET并未隨年齡的增加而增加，5周、16周及40周SHR的血漿ET含量無顯著差異。提示血漿ET在隨著年齡增加的高血壓發展中未發現明顯的作用，而可能僅與血壓升高的程度相關。

綜上所述，心血管活性物質在原發性高血壓的發病過程中起著十分重要的作用，體內調節血管舒縮及氧化應力變化的活性物質自身處在一個動態平衡之中，各物質之間互相影響與制約。

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Endotheliumfunctionandoxidationstressinspontaneoushypertensiveratsofdifferentweeksofage

LI Hong, WANG Lei, XIAO Chuan-shi, YANG Hui-yu

(DepartmentofCardiology,TheSecondHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:ganxibaozhongxin@sina.com)

AIM: To observe the endothelial function and oxidation stress in spontaneous hypertensive rats (SHR) of different weeks of age.METHODSEndothelium-dependent vasodilation of exsomatized aorta thoracalis and renal artery in 5 week-, 16 week- and 40 week-old SHR was observed and compared. Radioimmunoassay and the methods of nitrate reductase, thiobarbituric acid and 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) were used to measure the levels of endothelin (ET), nitric oxide(NO),malondialdehyde(MDA) and glutathione peroxidase(GSH-Px),respectively.RESULTSThe results indicated that the endothelium-dependent vasodilation was weakened along with aging. Vasoactive substance such as NO/ET and the oxidized stress symbolized by GSH-Px or MDA were also changed along with aging. The level of serum NO in 16 and 40 week-old SHR were lower than that in 5 week-old SHR[ (12.84±1.58) μmol/L and (12.17±1.17) μmol/Lvs(22.64±1.69) μmol/L](P<0.01). No significant difference of the ET level among the 3 groups was observed. The level of MDA[ (13.71±1.47) ng/L] in 40 week-old animals was significantly higher than that in 5 week-old SHR[(7.54±1.19)ng/L] and 16 week-old SHR [(7.94±0.83) ng/L] (P<0.01). The activity of GSH-Px in 40 week-old SHR [(2 368.00±60.39)×103U/L] was significantly lower than that in 5 week-old SHR [(2 925.00±75.11)×103U/L] and 16 week-old SHR [(2 976.00± 329.94)×103U/L] (P<0.01).CONCLUSIONThe damaged endothelial function and increased oxidation stress are existed in SHR and are aggratated with aging.

Spontaneously hypertensive rats; Endothelial function; Oxidation stress; Hypertension

R331.3+6

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.035

1000-4718(2011)01-0179-04

2010-05-10

2010-10-19

山西省衛生廳科技攻關資助項目(No. 200818)

△ 通訊作者Tel:0351-3362132 ;E-mail-ganxibaozhongxin@sina.com