響應面優化超聲波輔助水酶法提取花生蛋白工藝

齊寶坤，江連洲，2，*，李 楊，2，韓宗元

(1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030; 2.國家大豆工程中心，黑龍江哈爾濱 150030)

響應面優化超聲波輔助水酶法提取花生蛋白工藝

齊寶坤1，江連洲1，2，*，李 楊1，2，韓宗元1

(1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030; 2.國家大豆工程中心，黑龍江哈爾濱 150030)

采用水酶法結合超聲波預處理提取花生蛋白，在單因素實驗基礎上，選出最優的超聲時間和超聲溫度，重點以酶用量、酶解pH、酶解溫度、酶解時間和料液比為考察的影響因子，花生蛋白提取率為響應值。確定最優復合酶水解的水酶法提取花生蛋白工藝條件為:加酶量為1.59%，溫度為56.5℃，酶解時間為3.9h，料水比為1∶4.4，pH為9.0，此時蛋白提取率為94.31%±0.37%。

花生蛋白，超聲波，水酶法

花生含有40%～50%的油脂和27%～29%左右的蛋白質，不僅是主要的油料作物，也是優質植物蛋白資源［1］，但我國對花生蛋白的研究相對滯后，大部分花生蛋白產品只能在低端市場徘徊，無法與國外產品競爭。傳統堿提法速度慢、時間長，且蛋白提取率低、生產成本高，而水酶法是一種新興的提取蛋白方法，它是以機械和酶解為手段破壞植物細胞壁，該技術處理條件溫和，工藝路線簡單，而且可以同時提取油和蛋白質，生產過程能耗相對低［2－3］。超聲波輔助提取技術是一種新的提取分離技術，具有獨特的物理性能，可促使植物細胞組織破壁或變形，能夠產生增溶作用，使有效成分提取更充分，提取率相比于傳統工藝有所提高。超聲波對油脂、蛋白萃取分離的強化作用主要源于其空化效應，而超聲空化又引起了湍動效應、聚能效應、微擾效應和界面效應，因而超聲波可強化萃取分離過程的傳質速率和效果，從而有利于蛋白的提取，并且超聲波預處理會對花生細胞結構造成一定程度的損傷，同時對油脂與蛋白質結合體進行空化作用，有利于充分酶解［4－6］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生 市售，其中水分7.9%、脂肪49.7%、蛋白質25.5%;Alcalase2.4L堿性蛋白酶 最適溫度50～60℃，最適pH 8～10，酶活2000U/L，諾維信公司;氫氧化鈉、濃硫酸、無水硫酸銅等 均為市售分析純。

FA2004分析天平 上海市舜宇恒平科學儀器有限公司;pHS－3C酸度計 上海雷磁儀器廠; DZKW－S－4電熱恒溫水浴箱 北京市用光明醫療器械廠;JT－160W粉碎機、電動攪拌機 金壇市醫療器械廠;電熱恒溫鼓風干燥箱、自動定氮儀、消化爐上海纖檢儀器有限公司;超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;H－7650透射電子顯微鏡 日本HITACHI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花生油提取工藝流程 花生→烘干→脫紅衣→粉碎→加水調節料液比→超聲波處理→調節pH和溫度→酶解→滅酶→離心分離→花生蛋白

1.2.2 操作要點 脫紅衣∶將花生放于50℃烘箱中去除表皮水分，用手脫去花生紅衣。粉碎∶使用高速萬能粉碎機對脫皮花生進行充分粉碎，直至物料呈半固態漿狀。超聲波處理∶將調好料液比的原料放于超聲波細胞破碎儀中處理20min。酶解∶調節好pH后，加入一定量的Alcalase 2.4L堿性蛋白酶。滅酶∶將水浴鍋中溫度升為100℃進行滅酶，時間為10min。離心∶將物料趁熱轉移至具塞離心杯中進行離心(4500r/min，20min)。

1.2.3 花生蛋白提取率的計算 總蛋白提取率(%) =(花生總含蛋白質量－酶解提取后殘渣含蛋白質量)/花生總含蛋白質量×100%

1.2.4 實驗設計 在單因素研究的基礎上，在最優的超聲時間和超聲溫度條件下，選取加酶量、酶解溫度、酶解時間、料水比和酶解pH 5個因素為自變量，以總蛋白提取率y1為響應值，根據中心組合設計原理，設計響應面分析實驗，其因素水平編碼表見表1。

表1 因素水平編碼表

2 結果與分析

2.1 超聲波處理單因素實驗

2.1.1 超聲時間對花生蛋白提取率的影響 在超聲溫度為45℃、酶解時間為3.5h、料液比為1∶4、酶用量2.0%、酶解溫度55℃、pH9條件下，考察超聲時間對花生蛋白提取率的影響，結果見圖1。

圖1 超聲波處理時間對花生蛋白提取率的影響

由圖1可知，起初花生蛋白提取率隨時間的延長而增大，當超聲波處理時間為15min時，達到最大值，之后隨時間的延長而逐漸下降。由于超聲波作用在開始的時間內對細胞膜的破碎作用比較大，溶出物多，蛋白提取率不斷升高;但是隨著超聲時間的增加，溫度急劇升高，導致成分分解或揮發，故超聲波處理時間選擇15min。

2.1.2 超聲溫度對花生蛋白提取率的影響 在超聲時間為20min、酶解時間為3.5h、料液比為1∶4、酶用量2.0%、酶解溫度55℃、pH 9下，考察超聲溫度對花生蛋白提取率的影響，結果見圖2。

圖2 超聲波處理溫度對花生蛋白提取率的影響

由圖2可知，超聲波處理溫度為40℃時，花生蛋白提取率最大。因為超聲溫度低于40℃時，分子擴散運動小，物料的相互作用不夠完全，從而降低了花生蛋白提取率;而溫度高于40℃后，由于物料略有糊化，可能使得花生蛋白的提取率降低，故選擇超聲波處理溫度為40℃。

2.2 響應面實驗安排及實驗結果

本實驗應用響應面優化法進行過程優化，響應面實驗方案及結果如表2所示。

表2 實驗安排及結果

2.3 參數對花生蛋白提取率的響應面結果分析

通過統計分析軟件SAS9.1進行數據分析，建立二次響應面回歸模型如下∶

回歸分析與方差分析結果見表3。

表3 回歸與方差分析結果

應用響應面優化分析方法對回歸模型進行分析，尋找最優響應結果為∶加酶量為1.59%，溫度為56.5℃，酶解時間為3.9h，料水比為1∶4.4，pH為9.0，響應面有最優值為94.31%±0.37%。交互項顯著的響應面見圖3。

圖3 顯著交互項的響應面圖

2.4 驗證實驗

在響應面分析法求得的最佳條件下，進行3組驗證性實驗，結果分別為94.25%、93.88%、93.79%，取平均值為93.97%，因此采用響應面分析法優化得到的工藝參數準確可靠，說明響應值的實驗值與回歸方程預測值吻合良好，有較強的實用價值。在相同的酶解條件下未經超聲處理樣品的總蛋白提取率僅為90.83%。

2.5 超聲處理前后花生電鏡圖

圖4中a、b分別為超聲前后花生透射電鏡圖，由圖4可以看出，超聲波處理改變了物料的狀態，由聚集變為分散，并且對油脂與蛋白質結合體產生了空化作用，有利于充分酶解，進而有利于蛋白水解提取。

圖4 超聲前后花生透射電鏡圖

3 結論

利用響應面分析方法對超聲波預處理后水酶法提取花生蛋白的酶解工藝參數進行了優化，建立了相應的數學模型，為以后工業化生產提供理論基礎，并且得到了最優酶解工藝條件為加酶量為1.59%，溫度為56.5℃，酶解時間為3.9h，料水比為1∶4.4，pH為9.0。在最優酶解工藝條件下總蛋白提取率可達到94.31%±0.37%。

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Optimization of extraction of peanut protein with ultrasonic－assisted aqueous enzymatic methods by response surface methodology

QI Bao－kun1，JIANG Lian－zhou1，2，*，LI Yang1，2，HAN Zong－yuan1
(1.Food College，North East Agriculture University，Harbin 150030，China; 2.Soy Bean Engineering Technique Research Center，Harbin 150030，China)

Based on single factor experiment，the amount of complex enzymes，the optimum ultrasonic preirradiation temperature，time，enzyme hydrolysis pH，enzyme hydrolysis temperature and reaction time were chosen as influencing factors and the peanut protein yield was selected as response value.The optimum extraction conditions were as follows:amount of complex enzymes 1.59%，enzyme hydrolysis temperature 56.5℃，reaction time 3.9h，the ratio of material to liquid 1∶4.4 and enzyme hydrolysis pH 9.0.The peanut protein yield was 94.31%± 0.37%.

peanut protein;ultrasonic pre－irradiation;aqueous enzymatic method

TS201.2+1

B

1002－0306(2011)11－0253－04

2011－08－01 *通訊聯系人

齊寶坤(1986－)，男，碩士研究生，研究方向:糧食、油脂及植物蛋白工程。