蜜環(huán)菌菌粉中甘露醇測(cè)定方法的比較與優(yōu)化

朱顯峰，范書軍，余晨晨，秦仁炳

(河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究所，河南開封 475004)

蜜環(huán)菌菌粉中甘露醇測(cè)定方法的比較與優(yōu)化

朱顯峰，范書軍，余晨晨，秦仁炳

(河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究所，河南開封 475004)

目的:比較對(duì)蜜環(huán)菌菌粉的不同預(yù)處理方法和甘露醇含量測(cè)定方法，篩選更有效的方法對(duì)蜜環(huán)菌菌粉中甘露醇含量進(jìn)行測(cè)定。方法:用醇提取、水提取和超聲波破碎法對(duì)蜜環(huán)菌菌粉進(jìn)行甘露醇提取比較，并選出最優(yōu)者;使用濃鹽酸與樣品液共熱去除果糖干擾;采用碘量法和分光光度法分別對(duì)蜜環(huán)菌菌粉進(jìn)行甘露醇含量測(cè)定比較。結(jié)果:以水為溶劑，80℃下對(duì)蜜環(huán)菌菌粉進(jìn)行超聲波破碎，相對(duì)醇提取法和水提取法能有效提高甘露醇測(cè)定值;濃鹽酸與樣品液沸水共熱可有效去除果糖干擾;在存在葡萄糖等單糖對(duì)甘露醇干擾的情況下，分光光度法測(cè)定值相對(duì)碘量法更準(zhǔn)確。結(jié)論:以超聲波破碎預(yù)處理、濃鹽酸去除果糖干擾，采用分光光度法為具體測(cè)定方法的組合方式為最佳測(cè)定方法。

甘露醇，蜜環(huán)菌，超聲波破碎法，分光光度法

蜜環(huán)菌(Amillariella mellea)，屬于擔(dān)子菌亞門白蘑科，與天麻共生，是一種藥食兩用真菌［1］。蜜環(huán)菌具有安眠、抗驚厥、治療心腦血管疾病、增強(qiáng)免疫力等作用［2］。甘露醇是蜜環(huán)菌產(chǎn)品制劑的重要活性成分之一，具有利尿脫水、降低血黏度、改善微循環(huán)等作用［3］，其含量也成為蜜環(huán)菌產(chǎn)品的質(zhì)量控制指標(biāo)之一。因此，對(duì)蜜環(huán)菌產(chǎn)品制劑中甘露醇含量進(jìn)行有效測(cè)定至關(guān)重要。目前，對(duì)蜜環(huán)菌菌粉等蜜環(huán)菌產(chǎn)品制劑主要采用有機(jī)溶劑加熱回流進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)果糖等單糖的干擾因素往往未予考慮，造成測(cè)定結(jié)果誤差偏大，測(cè)定甘露醇含量方法上以碘量法為主，難以實(shí)現(xiàn)快速測(cè)定［4］。本實(shí)驗(yàn)從蜜環(huán)菌菌粉制劑預(yù)處理、對(duì)樣品液脫水處理去除干擾因素影響和蜜環(huán)菌中甘露醇含量測(cè)定方法三方面進(jìn)行了研究，力求使測(cè)定方法更加準(zhǔn)確、方便、快速、有效。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蜜環(huán)菌菌粉制劑 由河南龍都藥業(yè)有限公司提供;高碘酸鈉 華東師范大學(xué)化工廠，分析純;L－鼠李糖、甘露醇、乙酸銨、乙酰丙酮 天津市化學(xué)試劑三廠，分析純;冰醋酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉、果糖、葡萄糖、濃鹽酸、濃硫酸 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純。

TU－1800紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;JYD－150智能型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 上海之信儀器有限公司;高效索氏提取器ST－80 北京賽福萊博科技有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋HH－8 常州國(guó)華電器有限公司。

表1 不同預(yù)處理方式的測(cè)定結(jié)果比較(mg/g)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蜜環(huán)菌菌粉的預(yù)處理方法

1.2.1.1 水提取法 精確稱取蜜環(huán)菌菌粉5份，每份0.5g，放入500mL三角瓶中，加蒸餾水250mL，80℃水浴提取1.5h，冷卻，取提取液離心，取上清1mL適當(dāng)稀釋即為供試樣品液。

1.2.1.2 醇提取法 精確稱取蜜環(huán)菌菌粉5份，每份0.5g，用濾紙包好，并取同型濾紙作空白對(duì)照，將包好的菌粉及空白濾紙分別放入索氏提取器，加95%乙醇180mL，加熱回流循環(huán)兩次，待第三次剩余乙醇10%左右時(shí)，加蒸餾水20mL，繼續(xù)蒸餾出殘余乙醇，剩余液體移至250mL容量瓶，定容，取1mL適當(dāng)稀釋即得供試樣品液。

1.2.1.3 超聲波破碎法 精確稱取蜜環(huán)菌菌粉5份，每份0.01g，置于10mL短試管中，加蒸餾水8mL，利用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎，功率260W，操作溫度80℃，時(shí)間15min，冷卻，將破碎液離心，取上清液1mL適當(dāng)稀釋即為供試樣品液。

1.2.2 脫水處理方法 制備如下樣品液∶甘露醇溶液(1g/L)，甘果混合液(甘露醇1g/L，果糖0.2g/L)，甘葡混合液(甘露醇1g/L，葡萄糖0.2g/L)，總混合液(甘露醇1g/L，果糖0.2g/L，葡萄糖0.2g/L)。取2mL樣品液置具塞試管中，加3mL濃鹽酸，沸水共熱10min，冷卻，適當(dāng)稀釋即為脫水處理供試樣品液［5］;取2mL未經(jīng)脫水處理的樣品液，稀釋相同倍數(shù)即為經(jīng)脫水處理的供試樣品液。

1.2.3 甘露醇含量測(cè)定方法

1.2.3.1 分光光度法 方法∶取1mL供試樣品液置于具塞試管中，分別加入1mL高碘酸鈉溶液(取高碘酸鈉0.321g溶于100mL 0.12mol/L鹽酸溶液中)混勻，室溫下放置10min，加入0.1%L－鼠李糖溶液2mL，混勻后加入4mL新配制的Nash試劑(15g乙酸銨+ 0.2mL冰醋酸+0.2mL乙酰丙酮，定容至100mL)，混勻，在53℃恒溫水浴中加熱15min，放冷，以蒸餾水作空白對(duì)照，在413nm處測(cè)定吸光度［6］。

原理∶高碘酸鈉與甘露醇反應(yīng)生成黃色的3，5－二乙酰－1，4脫氫二甲基吡啶，該物質(zhì)在413nm處有最大吸收峰，可測(cè)定出相應(yīng)吸光度，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)甘露醇進(jìn)行計(jì)算。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作∶精密量取甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1mg/mL)0.01、0.02mL依次至0.08mL，分別置于10mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，再各取1mL分別置于具塞試管中，按照上述方法進(jìn)行吸光度測(cè)定。按吸光度(X)對(duì)甘露醇(Y)含量作圖，得回歸方程∶Y=0.0952X+0.00306，r=0.99866。

1.2.3.2 碘量法［7］方法∶精確量取供試樣品液4mL，置碘量瓶中，精確加入高碘酸鈉溶液［濃硫酸溶液(1→20)90mL與高碘酸鈉溶液(1→1000)110mL混合制成］50mL，置水浴上加熱15min，放冷，加碘化鉀試液5mL，密塞，搖勻，反應(yīng)5min，用硫代硫酸鈉滴定液(0.03mol/L)，滴定至淺黃色時(shí)，加淀粉指示劑1mL，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，并將滴定結(jié)果用空白實(shí)驗(yàn)(不加供試樣品液，僅高碘酸鈉溶液參與反應(yīng))校正。每1mL硫代硫酸鈉滴定液(0.03mol/L)相當(dāng)于0.5465mg的甘露醇。

原理與計(jì)算∶甘露醇在酸性溶液中被高碘酸鈉氧化生成碘酸鈉，剩余的高碘酸鈉以及反應(yīng)生成的碘酸鈉均可與碘化鉀反應(yīng)生成碘，利用標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉滴定液對(duì)碘滴定至終點(diǎn)，可得硫代硫酸鈉滴定液的消耗量，記作V硫代硫酸鈉(mL)，空白實(shí)驗(yàn)的滴定量記作V空白(mL)。

供試樣品液中甘露醇含量(mg/mL)=(V空白－V硫代硫酸鈉)× 0.5465/4

2 結(jié)果與討論

2.1 不同預(yù)處理方法對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

按照上述方法分別以水提取法、醇提取法和超聲波破碎法對(duì)菌粉進(jìn)行預(yù)處理，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見表1。

對(duì)以上結(jié)果進(jìn)行比較表明，超聲波破碎法(平均值54.91mg/g，RSD 1.30%)預(yù)處理效果最好，水提取法(平均值42.77mg/g，RSD 1.46%)次之，醇提法(平均值25.81mg/g，RSD 2.78%)最差。

2.2 脫水處理對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

精確量取1.2.2中制備的脫水處理與未脫水處理供試樣品液利用分光光度法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。

未經(jīng)脫水處理時(shí)，果糖對(duì)甘露醇測(cè)定的干擾較大，葡萄糖較小。經(jīng)脫水處理后果糖干擾得到了有效降低，此時(shí)葡萄糖的干擾極小，處于甘露醇測(cè)定的誤差范圍以內(nèi)，可以忽略不計(jì)。

2.3 分光光度法與碘量法的比較

2.3.1 對(duì)甘露醇混合液的測(cè)定結(jié)果比較 取1.2.2中制備的甘露醇溶液、總混合液以及脫水處理過(guò)的總混合液，分別利用分光光度法和碘量法進(jìn)行含量測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表3 分光光度法和碘量法對(duì)蜜環(huán)菌菌粉中甘露醇含量測(cè)定的比較(mg/g)

圖1 脫水處理對(duì)甘露醇測(cè)定的影響

表2 分光光度法和碘量法對(duì)甘露醇混合液中甘露醇含量測(cè)定的比較(g/L)

上述兩種方法對(duì)純甘露醇溶液中甘露醇含量的測(cè)定都有著很高的精確度，而對(duì)總混合液中甘露醇含量的測(cè)定，無(wú)論是否經(jīng)過(guò)脫水處理，碘量法的測(cè)定結(jié)果都遠(yuǎn)偏離于真實(shí)值，而分光光度法則非常接近真實(shí)值。

2.3.2 對(duì)蜜環(huán)菌菌粉的測(cè)定結(jié)果比較 精確稱取同一批次蜜環(huán)菌菌粉5份，經(jīng)超聲波破碎，濃鹽酸脫水處理后，分別以分光光度法和碘量法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表3所示。

經(jīng)脫水處理后，蜜環(huán)菌菌粉中甘露醇含量的測(cè)定值較處理前(見表 1)有所下降，平均值由54.91mg/g降為 50.19mg/g。而碘量法的測(cè)定值(79.02mg/g)與分光光度法的測(cè)定值(50.19mg/g)相比，碘量法的測(cè)定值較大，參照2.3.1的測(cè)定結(jié)果，表明碘量法的測(cè)定值存在較大誤差。

2.4 討論

由于甘露醇在乙醇中的溶解度偏低，所以水提取法優(yōu)于醇提取法，而超聲波破碎法可使菌粉中的甘露醇得到更大程度的釋放，比水提取法更有效地提高了測(cè)定值。使用濃鹽酸與樣品液沸水共熱，使樣品液中的果糖脫水生成糠醛，有效降低了果糖對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。在碘量法中，葡萄糖、甘露糖、果糖等單糖亦可與高碘酸反應(yīng)，造成滴定結(jié)果偏大，對(duì)測(cè)定結(jié)果造成了較大干擾。在除去大部分果糖影響后，分光光度法相對(duì)碘量法更準(zhǔn)確。

3 結(jié)論

以超聲波破碎法對(duì)菌粉進(jìn)行預(yù)處理，濃鹽酸與樣液共熱除去果糖干擾，采用分光光度法進(jìn)行具體測(cè)定的組合方式為有效測(cè)定蜜環(huán)菌菌粉制劑中甘露醇含量的最佳方法。

［1］卯曉嵐.中國(guó)經(jīng)濟(jì)真菌［M］.北京:科學(xué)出版社，1998:133.

［2］宋成芝，徐燕.蜜環(huán)菌的化學(xué)成分及藥理作用研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(10):5119－5120.

［3］山曉瑞.甘露醇的臨床應(yīng)用［J］.中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2008，2(9):52－53.

［4］殷永偉，王玉霞，耿琴.高碘酸鈉法測(cè)定暈痛定膠囊中甘露醇的含量［J］.數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，2009，22(4):477－478.

［5］蔣華，陳衛(wèi)，趙建新，等.分光光度法測(cè)定乳酸菌發(fā)酵體系中甘露醇的含量［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(4):105－107.

［6］李雪芹，包天桐，王雁，等.比色法測(cè)定冬蟲夏草中甘露醇的含量［J］.中草藥，1999，30(1):19－21.

［7］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典二部［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005: 72.

Comparison and optimization of the method to determine the content of mannitol in Amillariella mellea powder

ZHU Xian－feng，F(xiàn)AN Shu－jun，YU Chen－chen，QIN Ren－bing
(Institute of Bioengineering and College of Life Science，Henan University，Kaifeng 475004，China)

Objective:To establish a method to quickly extract and determinate the mannitol from the Amillariella mellea powder.Methods:The experimentation were studied from three aspects:the first is to choose an effective method of extraction，the second is to eliminate the interference from frucdose and the third is to choose an accurate mannitol determination method between the iodometric method and the colorimetric method.Results:The ultrasonic wave breaking method which choose water as the solution and set the operating teperature in 80℃ is more effective than water extraction method and ethanol extraction method.When 3mL concentrated hydrochloric acid and 2mL sample solution boiled together in 10min，the most interference from frucdose can be eliminated，and the colorimetric method is more accurate than the iodometric method.Conclusion:When the interference of frucdose has been eliminated，the best way to extract and determinate the mannitol in Amillariella mellea powder is the combination of the ultrasonic wave breaking method and the colorimetric method.

mannitol;Amillariella mellea;ultrasonic wave breaking method;colorimetric method

TS207.3

A

1002－0306(2011)11－0454－03

2010－10－11

朱顯峰(1973－)，男，博士，副教授，主要從事微生物與生化藥學(xué)的研究。

河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(102102310016)。