湘潭職業(yè)技術(shù)學(xué)院 李 君 李俊雅
河南羚銳制藥股份有限公司 袁德先
南五味子葉綠體DNA的提取
湘潭職業(yè)技術(shù)學(xué)院 李 君 李俊雅
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隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RandomAmplifiedPolymorphic DNA,RAPD)是在DNA水平上進(jìn)行遺傳標(biāo)記的常用分析方法之一。在操作過(guò)程中,DNA的提取質(zhì)量是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果最為關(guān)鍵的因素。本文,筆者在對(duì)五味子進(jìn)行分子生物學(xué)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)南五味子葉中多酚、多糖、蛋白質(zhì)等復(fù)雜的次生、初生代謝物質(zhì),給葉綠體DNA提取造成很大的影響。因此,本文,筆者對(duì)傳統(tǒng)的葉綠體DNA提取方法進(jìn)行了改良,對(duì)南五味子葉綠體DNA的提取方法進(jìn)行了研究,在確定有效的提取方法并獲得高質(zhì)量的葉綠體DNA后,為下一步優(yōu)選適合的RAPD條件創(chuàng)造了條件。
1.實(shí)驗(yàn)材料。南五味子葉片由貴州GAP基地提供,葉片臨用前先用去離子水浸泡,使其變軟,展開(kāi),洗去表面灰塵,然后用酒精棉球擦拭其表面,以達(dá)到滅菌的目的,防止外源性DNA的污染,晾干或用吸水紙吸干備用。
2.試劑。液態(tài)氮,PVP(聚乙烯基吡咯烷酮),提取緩沖液A(50mmol/L Tris-HClpH=3.6,25mmol/L EDTA,1.25mol/L NaCl),提取緩沖液B(50mmol/LTris-HClpH=3.6,25mmol/L EDTA,1.25mol/LNaCl,10mmol/Lβ-巰基乙醇),提取緩沖液C(0.15mol/LNaCl,100mMEDTApH=8.0),提取緩沖液D(50mmol/LTris-HClpH=8.0,25mMEDTA),提取緩沖液E(0.35mol/L 山 梨 醇 ,100mmol/L Tris-HClpH=8.0,5mM EDTA),β-巰基乙醇,MgCl2(1mol/L),10%SDS(十二烷基磺酸鈉),10%十二烷基肌氨酸鈉,蛋白酶K。以上Tris(三(羥甲基)氨基甲烷)、蛋白酶K及RNaseA(核糖核酸酶A)均為上海生工試劑,其他為市售分析純。UNIQ-10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(SK1203,Sangon)。
在常規(guī)的葉綠體DNA提取方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行方法學(xué)考察。
1.常規(guī)的葉綠體DNA提取方法。取干燥葉片1.5~2g,4℃暗處理過(guò)夜,沖洗干凈,吸干水分,去中脈,剪碎后置勻漿器中,加入5倍體積4℃預(yù)冷的緩沖液A,勻漿;……