南五味子葉綠體DNA的提取

湘潭職業(yè)技術(shù)學(xué)院 李 君 李俊雅

河南羚銳制藥股份有限公司 袁德先

南五味子葉綠體DNA的提取

湘潭職業(yè)技術(shù)學(xué)院 李 君 李俊雅

河南羚銳制藥股份有限公司 袁德先

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RandomAmplifiedPolymorphic DNA，RAPD）是在DNA水平上進(jìn)行遺傳標(biāo)記的常用分析方法之一。在操作過(guò)程中，DNA的提取質(zhì)量是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果最為關(guān)鍵的因素。本文，筆者在對(duì)五味子進(jìn)行分子生物學(xué)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)南五味子葉中多酚、多糖、蛋白質(zhì)等復(fù)雜的次生、初生代謝物質(zhì)，給葉綠體DNA提取造成很大的影響。因此，本文，筆者對(duì)傳統(tǒng)的葉綠體DNA提取方法進(jìn)行了改良，對(duì)南五味子葉綠體DNA的提取方法進(jìn)行了研究，在確定有效的提取方法并獲得高質(zhì)量的葉綠體DNA后，為下一步優(yōu)選適合的RAPD條件創(chuàng)造了條件。

一、材料與試劑

1.實(shí)驗(yàn)材料。南五味子葉片由貴州GAP基地提供，葉片臨用前先用去離子水浸泡，使其變軟，展開(kāi)，洗去表面灰塵，然后用酒精棉球擦拭其表面，以達(dá)到滅菌的目的，防止外源性DNA的污染，晾干或用吸水紙吸干備用。

2.試劑。液態(tài)氮，PVP（聚乙烯基吡咯烷酮），提取緩沖液A（50mmol/L Tris-HClpH=3.6，25mmol/L EDTA，1.25mol/L NaCl），提取緩沖液B（50mmol/LTris-HClpH=3.6，25mmol/L EDTA，1.25mol/LNaCl，10mmol/Lβ-巰基乙醇），提取緩沖液C（0.15mol/LNaCl，100mMEDTApH=8.0），提取緩沖液D（50mmol/LTris-HClpH=8.0，25mMEDTA），提取緩沖液E（0.35mol/L 山 梨 醇 ，100mmol/L Tris-HClpH=8.0，5mM EDTA），β-巰基乙醇，MgCl2（1mol/L），10%SDS（十二烷基磺酸鈉），10%十二烷基肌氨酸鈉，蛋白酶K。以上Tris（三（羥甲基）氨基甲烷）、蛋白酶K及RNaseA（核糖核酸酶A）均為上海生工試劑，其他為市售分析純。UNIQ-10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒（SK1203，Sangon）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

在常規(guī)的葉綠體DNA提取方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行方法學(xué)考察。

1.常規(guī)的葉綠體DNA提取方法。取干燥葉片1.5～2g，4℃暗處理過(guò)夜，沖洗干凈，吸干水分，去中脈，剪碎后置勻漿器中，加入5倍體積4℃預(yù)冷的緩沖液A，勻漿；……