紫杉醇有關物質檢測HPLC法色譜條件優化

北京市朝陽區藥品檢驗所（100028）張艷霞

中國食品藥品檢定研究院（100050）孫磊

《中國藥典》2010年版二部已經收載紫杉醇原料藥及制劑的HPLC有關物質檢查法[1][2]。由于藥典和相關文獻[3][4]的色譜條件梯度變化較劇烈，造成紫杉醇主峰流出后的色譜圖基線波動較大，影響其后雜質峰的檢出和定量，因此筆者優化了色譜條件，并進行了方法學驗證，分析時間稍延長，但提供了更好的分離和識別效果。

1 儀器與試藥

Waters2695高效液相色譜儀（2487紫外檢測器，Epower2工作站），島津2010a高效液相色譜儀（紫外檢測器，CLASSVP工作站），紫杉醇、三杉尖寧堿（雜質Ⅰ）和7-表-10-去乙酰基紫杉醇（雜質Ⅱ）對照品均為USP reference standard，乙腈（色譜純，Fisher），實驗用水為Milli-Q系統制備，紫杉醇注射液。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為Alltech C18 (250 m m×4.6 m m×5 μm)；檢測波長227nm；柱溫35℃；流速1.2ml·min-1。乙腈為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫程序如下：

2.2 系統適用性試驗 取紫杉醇、雜質Ⅰ和雜質Ⅱ對照品適量，用乙腈溶解并稀釋制成每1ml含紫杉醇1.2mg、雜質Ⅰ和雜質Ⅱ各6μg的溶液作為系統適用性溶液。取該溶液連續進樣6次，進樣量15μl，理論板數按紫杉醇峰計應不低于25000，紫杉醇峰與雜質Ⅱ峰的分離度應不低于1.2，雜質Ⅱ峰面積的RSD應不大于2.0%。

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液 精密量取注射液2ml置10ml量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

附表 梯度洗脫程序

2.3.2 對照溶液 精密量取供試品溶液0.5ml置100ml量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 賦形劑溶液 精密量取賦形劑2ml置10ml量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 有關物質測定

取系統適用性溶液、對照溶液、供試品溶液和賦性劑溶液各15μl分別注入色譜儀，記錄色譜圖，60分鐘前所記錄的色譜圖中，扣除賦形劑溶液中的色譜峰，雜質Ⅰ（雜質Ⅰ峰面積乘以校正因子1.26）與其他單個雜質峰面積均不得大于對照溶液主峰面積（0.5%），各雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的4倍（2.0%），見附圖。

2.5 專屬性試驗 對紫杉醇注射液進行酸液（0.1mol/LHCl）、堿液（0.1mol/LNaOH）、氧化（3%H2O2）、高溫（80℃水浴加熱4.5小時）、光照（日光下直射30分鐘）等破壞試驗并用上述色譜條件檢查，結果表明光破壞、熱破壞、氧化破壞后的樣品未產生新雜質，酸和堿破壞的樣品產生新雜質，各雜質峰分離均良好。

2.6 線性范圍、檢出限和定量限 精密稱取紫杉醇對照品6.06mg，置入10ml量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。取該溶液配制成一系列濃度的7份溶液，每份溶液進樣2次，進樣量15μl。以進樣量（ng）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：y=1983.632x-5659.408，r=0.9997，表明紫杉醇在1.212～454.5ng范圍內呈良好的線性關系。

以信噪比S/N≈3，測得紫杉醇檢出限為40ng·ml-1；以信噪比S/N≈10，測得紫杉醇定量限80ng·ml-1。

2.7 穩定性和重復性 照供試品溶液制備法制備溶液1份，取該溶液分別在0h、5h、12h、16h和24h測定，進樣量15μl，各雜質峰面積RSD均小于2%，表明供試品溶液穩定性良好；照供試品溶液制備法制備溶液6份，取6份溶液各進樣2次，進樣量15μl，各雜質峰面積RSD均小于2.5%，表明重復性良好。

3 討論

流速考察 將流速降低到1.1ml·min-1，其他條件不變，有雜質峰消失；將流速升高到1.3ml·min-1，其他條件不變，雜質峰的數目和分離效果與原先基本一致。因此，流速應在1.2ml·min-1～1.3ml·min-1。

柱溫考察 將柱溫降至30℃，其他條件不變，有2個雜質峰消失；將柱溫升至40℃，其他條件不變，雜質峰的數目與原先基本一致，個別峰分離度更好。因此，柱溫應在35℃～40℃。

pH值耐用性 將pH值降低0.2單位，其他條件不變，雜質峰的數目和分離效果與原先基本一致；將pH值升高0.2單位，其他條件不變，雜質峰的數目和分離效果與原先基本一致。因此該方法能夠耐受較小的pH值變化。

色譜柱耐用性 另采用AKZO NOBEL Kromosil 100 C18色譜柱及迪馬鉆石C18色譜柱（均為250 mm×4.6mm×5μm）對同一樣品進行了測定，色譜圖基本一致，表明該法對色譜柱的耐用性較好。