MBL基因多態性與新疆漢族人群結核病易感性的研究*

李 宇,吳 芳,章 樂,張萬江

2.石河子大學新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室,石河子 832002

結核病是由結核分枝桿菌引起的一種重要傳染性疾病,是人類健康的主要殺手。據WHO統計,全球約有1/3的人感染結核桿菌,但其中不足1/10的感染者發展為結核病,且每年不到0.1%的感染者死于該病[1];這都提示個體遺傳差異與結核病易感性相關[2]。近年來,隨人類基因組流行病學的發展,宿主易感基因在結核病發生與進展中的作用更日益凸顯,并受到國內外廣泛關注,其中MBL基因就是當前的一個研究熱點。

甘露糖結合凝集素(Mannose-binding lectin,MBL)屬于Ca2+依賴型凝集素家族中的一員,它主要通過調理作用和激活補體途徑而發揮天然免疫防御功能。MBL天然免疫功能的發揮依賴于其充足的血清濃度和完整的多聚結構。已有研究證實,MBL血清濃度低下或結構缺損受MBL基因的6個多態性位點的影響,這其中包括位于啟動子區—550位的H/L,—221位的X/Y和+4位的P/Q以及外顯子1區的52、54、57,3個多態性位點。隨著對MBL的免疫防衛功能的逐步深入了解和結核病免疫機制的不斷闡明,人們對MBL基因與肺結核發病之間的關聯研究也取得了進一步突破。本研究采用病例-對照研究方法,應用序列特異性引物-聚合酶鏈反應(PCR-SSP)技術對我國新疆漢族結核病患者和健康對照者MBL基因的H/L、P/Q和A/B位點進行基因及單倍體分型,并比較其基因型和單倍體型分布頻率,探討MBL基因多態性與新疆漢族人群結核病的關聯。

1 材料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 肺結核病例組 在新疆塔城、石河子、沙灣縣等地區長期生活的漢族肺結核患者231例,其中男117例,女114例,年齡23～75歲,平均年齡39.2歲。入選標準為：①所有病例均按照1996年國家制定的肺結核診斷標準診斷為肺結核病;②無慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺癌、糖尿病、高血壓等并發癥;③無遺傳病家族史;④所有病例均排除具有結核病相似病癥者,同時排除HIV感染、腫瘤患者、長期使用激素、器官移植等免疫功能低下者;⑤在新疆地區居住時間20年以上。

1.1.2 正常對照組 與病例組生活地區相一致的漢族健康志愿者226例,其中男118例,女108例,年齡25～72歲,平均年齡36.8歲。入選標準為：①經胸部X線透視檢查無活動性肺結核病灶、無病理鈣化灶及病理性肺部陰影;②與病例組患者無血緣關系;③血清結核抗體檢測陰性;④無慢阻肺、哮喘、肺癌、糖尿病、高血壓等合并癥;⑤無遺傳病家族史和結核病史;⑥排除各種慢性病史以及接受激素治療引起免疫功能低下者。

1.2 主要試劑 Taq DNA聚合酶(北京天根生物工程公司)、蛋白酶K(上海生物工程有限責任公司)、DNTP(北京天根生物工程公司)、MBL引物(上海生物工程有限責任公司)、瓊脂糖(美國BBI公司)、DNA Marker(上海生物工程有限責任公司)、飽和酚/氯仿/異戊醇(上海生物工程有限責任公司)、溴酚藍(寶生物大連有限公司)、三氯甲烷(天津大茂化學試劑廠)。

1.3 主要儀器 PCR自動擴增儀(美國Bio-metra公司)、Bio—RAD梯度 PCR儀(美國Bio-RAD公司)、DYY-4型電泳儀(北京六一廠)、Gel Doc 2000凝膠成像系統(美國Bio-RAD公司)、凝膠成像儀(美國伯樂公司)、T U-1800紫外分光光度儀(北京普析通用儀器有限公司)、UV—2401PC紫外分光光度計(日本島津公司)、2-16K高速冷凍離心機(德國Sigma公司)、XW-80A渦旋振蕩器(上海精科實驗有限公司)。

1.4 外周血DNA的提取 采用酚-氯仿法提取全血基因組DNA。

1.5 MBL基因各位點的基因型和單倍體分型

1.5.1 引物設計及合成 參照文獻,委托上海生物工程有限責任公司,分別針對MBL基因H/L、P/Q、A/B 3個多態位點設計合成5對特異性引物(所選擇的位點、引物序列和引物位置見表1)。

表1 MBL基因分型及單倍體分型所需的特異性及通用引物Table 1 The Primers sequence and size for MBL alleles

1.5.2 MBL基因的 H/L、P/Q和 A/B位點的PCR-SSP分析 正向序列特異性引物Hf/Lf與反向序列特異性引物Pr/Qr,4條引物兩兩配對,共計4對組合分別對每個模板進行擴增。通用引物對PSMB8-1/PSMB8-2作為陽性內參照,在有陽性內參照出現的情況下根據產生的特異性條帶判斷H/L、P/Q位點的基因型和單倍體型。其中通用引物對擴增的片斷長度為862bp;4對特異性引物的擴增的片斷長度分別為662bp。如圖1所示：某個樣本的Hf/Pr和Lf/Pr引物對擴增產物陽性,因此我們可以判斷該樣本上述兩個位點的基因型分別為H L,PP;單倍體型則為 HP,LP。擴增體系為：ddH2O ：14.5μ L;10 ×buffer(Mg2+Plus)：2.5μ L;dNTP(2.5mmol/L)：2.5μ L;PCR Primer：上下游各0.5μ L;TaqDNA Polymerase：0.5μ L;Template DNA ：3.0μ L;HGH Primer：上下游各 0.5μ L;反應總量為25μ L。擴增條件：96℃預變性3min;96℃變性30s,62℃高溫退火45s,72℃延伸45s,共計10個循環;96℃變性30s,60℃中溫退火 45s,72℃延伸45s,共計20個循環;96℃變性45s,58℃低溫退火60s,72℃延伸60s,共計 5個循環;72℃延伸5min。

1.5.3 MBL基因的A/B位點的PCR-SSP分析針對野生型A等位基因引物對是MW-MGF,針對變異型B等位基因引物對為MU-MGR,通用引物對MGF-MGR。在有陽性內參照出現的情況下根據產生的特異性條帶判斷MBL基因的A/B位點的基因型。通用引物對擴增的片斷長度為651bp;A等位基因擴增的片斷長度為270bp;B等位基因擴增的片斷長度為423bp。擴增體系同前。擴增條件：96℃預變性 3min;96℃變性 30s,62℃退火 30s,72℃延伸30s,共計30個循環;72℃延伸5min。

1.6 分析方法 對所選樣本進行Hardy-Weiberg平衡檢驗,結果表明兩組資料的MBL各位點的基因型及單倍體型的頻率的觀察值和期望值之間的差異無統計學意義(P＞0.05),說明樣本基因型和單倍體型的頻率分布符合Hardy-weinberg平衡定理,它們在病例組和對照組人群中的分布是均勻的,來自同一個孟德爾群體,可以進行下一步研究。

采用χ2檢驗方法分析比較肺結核病例組與正常對照組人群中等位基因型及單倍體型的分布情況,并計算OR值及95%的可信區間。統計過程使用雙側檢驗,P＜0.05有顯著性差異。應用SPSS11.5統計軟件處理數據。

1.7 測序 選取10%MBL各位點等位基因PCR擴增產物,純化回收后送往上海生物工程技術服務有限公司進行測序。

2 結 果

2.1 MBL各位點的等位基因和單倍體型的頻率分布結果見表2、3。

表2 MBL基因各位點的等位基因頻率分布表Table 2 Allele locus frequencies of MBL genes

表3 MBL基因各位點的單倍體型頻率分布表Table 3 Haplotypes locus frequencies of MBL genes

2.2 PCR結果 健康對照組中的MBL基因AA基因型的頻率顯著高于肺結核病例組,兩組的頻率值分別是82.30%和74.03%,兩者經統計學分析有顯著性差異(χ2=4.576,OR=0.613,P＜0.05);肺結核病例組中的MBL基因AB基因型的頻率顯著高于健康對照組,兩組的頻率值分別為24.68%和16.37%,兩者有統計學意義(χ2=4.821,OR=1.673,P＜0.05)。而在所檢測的MBL基因H/L、P/Q兩個位點的等位基因及各單倍體型在兩組間的分布則無顯著性差異(P值均大于0.05)。

2.3 測序結果 隨機抽取上述位點的各等位基因型及單倍體型10%的陽性例數,送往上海生物工程有限責任公司進行測序,結果顯示經PCR擴增的目的片段與參考序列的同源性吻合率接近100%。

3 討 論

MBL是天然免疫防御系統的重要組成部分[3],其主要通過調理吞噬和活化補體等方式來清除病原體。MBL發揮免疫防御功能有賴于一定的血清濃度和四級結構的多聚形式,血清MBL水平低下將導致機體調理吞噬功能缺損,而結構缺失將影響MBL發揮正常的補體活化功能,從而使機體易患感染[4]。

目前有較多的研究報道MBL基因多態性與結核病的易感性相關。國外有研究者發現[5-6],印度人與美國黑人肺結核病例MBL-54位點基因突變頻率高于對照組;而在美國白種人、西班牙裔人、土耳其人中未發現MBL基因突變與肺結核有關聯[6-7],甚至發現MBL-57位點基因突變型為肺結核的保護基因[8];Hoal-Van等[9]在南美研究發現MBL-54位點雜合子突變型與對抗結核性腦膜炎;另外有研究顯示,在南非黑人當中,攜帶MBL的B等位基因的人不易患結核性腦膜炎和肺結核;LE Mombo[10]對非洲人群調查研究發現MBL-54、57位點基因突變型與結核病相關;Cosar[11]則發現 AB基因型和MBL血清低水平有益于抵抗結核病,特別是對于非洲肺結核兒童患者而言。國內學者馮福民[12-13]等人研究發現MBL-52、54位點基因突變型與北方漢族肺結核發病有關;而劉瑋博士[14]等人對中國漢族人群的MBL基因H/L、X/Y、P/Q和A/B四個多態性位點進行基因型及單倍體型分析后發現HL和 LL基因型是結核病的抵抗基因;并且發現LPYB、LPXA單倍體型與肺結核發病有關聯。

本課題采用序列特異性引物-聚合酶鏈反應(PCR-SSP)技術對MBL基因H/L、P/Q和A/B三個位點的多態性進行基因型和單倍體分型,發現MBL基因AB基因型可能是新疆漢族人群結核病的易感基因,這與馮福民文獻報道的我國北方漢族人群結核易感等位基因結論相同,與國外部分文獻報道的印度人、美國黑人、非洲人群的結核易感等位基因也一致;但與國外其它有些文獻報道的結論相悖;而MBL基因AA基因型可能是結核病的抵抗基因這一結論迄今為止國內外尚未見有關報道。這進一步證實了結核病MBL基因的相關等位基因的分布存在人種、民族和地域的差異。

新疆漢族是我國比較特殊的一個群體,其特殊性在于它來源廣泛。自古以來新疆就經歷著各民族的遷徙融合,從西漢時起,中原漢族人就通過屯墾戍邊的途徑流入新疆。隨著新中國的成立以及屯墾戌邊政策的繼續推行,全國各地更多的漢族人涌入該區域;所以我們從理論上可以推測其MBL基因的多態性融合了不同地區漢族人的特性,加上新疆地理、氣候、飲食等環境因素與內地相差比較顯著,有可能會引起久居于此的漢族人群這一整體的MBL基因多態性結構發生深刻的變化。而這很可能就是新疆漢族人群為什么是我國結核病高發人群的一個重要原因,也可能是當地漢族人MBL結核易感基因型獨特性的原因所在。

雖然本課題研究未發現MBL基因H/L、P/Q位點的基因型以及其單倍體型與結核病有關聯,但僅僅依據某次研究結果并不能完全否認其與結核病的發生發展有內在聯系的可能。這是因為：MBL基因啟動子區有三個SNP位點,分別為-550位的H/L,-221位的X/Y及+4位的P/Q,研究表明這三個位點并不獨立,而是以一定形式的單倍體型存在,因此如果想探討MBL基因多態性與結核病的關聯,最好要對三個位點進行單倍體型檢測,缺乏其中任何一個位點的研究都不會具備充足的意義。據以往的研究發現我國漢族人群外顯子區僅有54位點突變,如果可以同時聯合考察MBL基因結構區和啟動子區在研究人群的連鎖不平衡模式并進行單倍體型分析,或許更有助于找出與結核病相關聯的遺傳標記[15]。

由于結核病是多基因遺傳病,個體對結核病易感性的差異,可能是由少數幾個主效基因(major gene)或多個微效基因(minor gene)共同決定的[16];因此我們無法單從某個基因的多態性角度來完整的解釋其與結核病易感性之間真正的關聯;且結核病的發病與周圍環境因素密切相關,這提醒我們在從宿主遺傳角度探討結核病易感性的時侯,要注意進行主效基因和微效基因間以及基因與特定環境因素間交互作用的研究。此外,無法排除樣本量的不均和基因分型技術的不統一造成的研究結果缺乏可比性。因此,只有全面考察和分析比較結核病發病的各個層面和所有環節,我們最終才能確切清晰結核病發病的相關機制,為今后制定完善的防癆和抗癆等醫療措施奠定堅實的理論基礎。

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