西藏墨脫縣多斑按蚊復合體尚未發生擊倒抗性突變*

劉 茜,武 松,湯林華,周水森,黃 芳,葉苗青,洪結鳳,俞俊峰

2.中國疾病控制中心寄生蟲病預防控制所,世界衛生組織瘧疾、血吸蟲病和絲蟲病合作中心,上海 200025

西藏自治區的瘧疾流行歷史較為久遠,病例主要分布于雅魯藏布江河谷下游林芝地區的墨脫和察隅兩縣,其中以墨脫縣為主,該縣為我國瘧疾發病最高的地區之一。媒介防制為瘧疾消除非常重要的手段,使用擬除蟲菊酯類殺蟲劑進行媒介控制是當前媒介成蚊防制的重要措施。在殺蟲劑控制媒介的過程中應該密切監測蚊蟲對殺蟲劑的敏感性。目前我國已有多次報道傳瘧按蚊出現擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性[1-6],敏感性檢測主要采用的是WHO推薦的接觸法,該方法要求必須將現場捕獲的一定數量的飽血按蚊帶回實驗室產卵,孵育至子一代蚊蟲方可進行測試,對技術要求高、難于實施,尤其對交通極為不便,防瘧隊伍薄弱的墨脫縣,該法幾乎不可能實施。筆者對該縣的傳瘧媒介偽威氏按蚊的鈉離子通道蛋白基因進行了擴增和測序,結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 蚊蟲來源 按蚊成蚊采用人帳誘和誘蚊燈誘捕自墨脫縣達木鄉達木村(調查點海拔1 408m,N：29°49.627,E：95°46.227)與珠村(調查點海拔 1 510m,N ：29°31.120,E ：95°25.464);墨脫鎮墨脫村(調查點海拔 1178m,N ：29°19.285,E ：95°19.862);低海拔背崩鄉地東村(調查點海拔 853m,N：29°21.905,E：95°09.829)和背崩村(調查點海拔831m,N ：29°24.563,E：95°17.444)。 現場調查時間為2010年7月14日至2010年8月17日,多斑按蚊復合體具體種型通過分子方法鑒定[7]。多斑按蚊復合體5成員種鈉離子通道蛋白基因序列研究中偽威氏按蚊與威氏按蚊來自西藏墨脫縣和云南勐臘,多斑按蚊、塞沃按蚊和達羅毗按蚊基因組由第二軍醫大學馬雅軍教授惠贈。

1.2 主要儀器和試劑 PCR擴增儀(PTC-200型)購自美國Bio-Rad公司;凝膠成像系統(Alpha Imager HP/EP)購自美國Alpha Innotech公司;電泳儀(DYY-2C型)購自北京六一儀器廠;DNA聚合酶和脫氧核苷三磷酸(dNTPs)購自上海賽百盛基因技術有限公司;RNA酶和蛋白酶K購自上海鼎國生物技術有限公司。

1.3 分子實驗方法

1.3.1 基因提取 采用簡易快速DNA提取法[8],將1～2個蚊腿置于1.5mL離心管,加入35μ L裂解液(10mmol/L pH8.0 Tirs HCl,1mmol/L EDTA,1%Nonidet P-40,100μ g/mL 蛋白酶 K),勻漿 ;再加入35μ L消毒雙蒸水,煮沸 5min;10 000r/min離心2min,取上清液置-20℃備用。

1.3.2 鈉離子通道蛋白基因擴增 采用文獻報道[9]的簡并引物進行多斑按蚊復合體5成員種鈉離子通道蛋白基因IIS4-S6區段基因擴增,正向引物Gen1F ：5′-GGAGARTGGATYGA RTCNATGTGGGA-3′ , 反 向 引 物 Gen1R：5′-TTNGACAAAAGCAAGGCTAAG AA-3′。PCR反應體系為 50 μ L ：10 ×PCR 緩 沖液 ,5.0 μ L,25 mmol/L MgCl24 μ L,10 mmol/L dNTPs 1.0 μ L,正向 、反向引物各0.8 μ L(20 mmol/L),red Taq聚合酶 2.0 μ L(1 U/μ L)、DNA 模板 2.5 μ L,加水補至 50 μ L 。PCR反應條件：95℃10 min,94℃30 s,50℃30 s,72℃45 s,共35個循環,最后72℃溫育5min。

1.3.3 測序驗證 對上述擴增出的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,并成像拍照,切取目標條帶進行純化,采用測序試劑盒和全自動測序儀對擴增產物雙向測序(由上海生工生物工程技術服務有限公司完成),據測序圖驗證PCR抗性檢測結果,多斑按蚊復合體5成員種序列比對采用Bioedit軟件完成。

2 結 果

我國多斑按蚊復合體5成員種采用簡并引物全部擴增出片段約為208bp的目標條帶,目標條帶測序比對,獲得5成員種VGSC IIS4-S6區段基因序列信息如圖1。圖中加框所在位置為鈉離子通道蛋白基因L1014位點,圖中可見多斑按蚊復合體5成員種該位點序列一致,均為TTA,即亮氨酸(L)。

圖1 我國多斑按蚊復合體鈉離子通道蛋白基因DII6區段基因序列信息Fig.1 Voltage-gated sodium channel DII6 segment nucleotide sequence of five members of Anopheles maculatus complex in China

對調查點捕獲的多斑按蚊復合體進行分子種型鑒定后,選取墨脫縣達木鄉達木村(偽威氏按蚊20只,威氏按蚊20只)與珠村(偽威氏按蚊20只,威氏按蚊20只);墨脫鎮墨脫村(偽威氏按蚊20只,威氏按蚊2只);低海拔背崩鄉地東村(偽威氏按蚊20只,威氏按蚊12只)和背崩村(偽威氏按蚊20只,威氏按蚊7只)。共偽威氏按蚊100只,威氏按蚊61只,所有標本測序后,均未發現突變,結果見圖2。圖中加框位置為L1014位點,所有標本該位置測序結果顯示均未發生突變。

3 討 論

多斑按蚊復合體是馬來西亞、越南、泰國、緬甸、印度尼西亞、老撾等地的傳瘧媒介之一[10-12]。董學書[13]研究發現云南省偽威氏按蚊和多斑按蚊的人血指數分別為42.88%和35.71%,其密度的季節消長與瘧疾流行關系密切。周紅寧[14]采用ELISA方法檢測多斑按蚊復合體中瘧原蟲環子孢子蛋白(CSP)發現陽性。武松[15]等發現西藏瘧疾流行區墨脫縣多斑按蚊復合體包括偽威氏按蚊和威氏按蚊,并且在偽威氏按蚊唾液腺中PCR擴增出間日瘧子孢子基因,從分子角度判定了偽威氏按蚊為墨脫縣的傳瘧媒介。同時筆者于2010年在西藏墨脫達木鄉研究發現威氏按蚊種群密度高于偽威氏按蚊,也初步具備傳瘧條件,因此筆者對西藏的這兩種按蚊的鈉離子通道蛋白基因均進行了擴增研究。

本次研究采用簡并引物,擴增出了我國多斑按蚊復合體5成員種的VGSC IIS4-S6區段基因,為以多斑按蚊復合體為傳瘧媒介的地區擬除蟲菊酯抗性檢測提供了基因信息,5成員種L1014位點均為T TA(亮氨酸)。本次共測序偽威氏按蚊和威氏按蚊161只,經仔細核對測序圖,所有標本L1014位點均未發生突變。偽威氏按蚊和威氏按蚊在墨脫縣不同海拔分布見差異懸殊,因此在低海拔的墨脫鎮和背崩鄉僅捕獲的威氏按蚊19只,全部進行擴增測序分析。中高海拔達木鄉(約1 500m),兩個自然村捕獲的偽威氏按蚊和威氏按蚊均較多,因此每村兩種按蚊各選取20只進行分析。研究結果顯示墨脫縣的偽威氏按蚊和威氏按蚊擊倒抗性均尚未發生,意味著兩種按蚊對擬除蟲菊酯類殺蟲劑應該敏感。主要因為該地區村民幾乎不使用防蚊藥品,同時按蚊滋生地稻田常年水質流動,致使本來使用量就較少的農藥殺蟲劑對按蚊的抗性產生影響較小。

圖2 偽威氏按蚊與威氏按蚊L1014位點測序信息圖Fig.2 Map of VGSCL1014 of An.pseudowillmori and An.willmori upper part：An.pseudowillmori;below part：An.willmori

本研究初步獲得了我國多斑按蚊復合體5成員種的鈉離子通道蛋白基因序列信息,并通過測序發現西藏瘧疾流行區偽威氏按蚊和威氏按蚊均未發生擊倒抗性突變,為該地區在瘧疾防治中實施媒介控制方案提供了分子實驗的依據,并為該地區實施瘧疾消除過程中進行媒介抗性監測提供了前期的分子依據,并為進一步建立分子抗性檢測方法提供了基礎。

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