離體肝切除聯合自體肝移植大鼠模型的建立

劉文淵，張玉君，徐土炳，林 恒，別 平 (第三軍醫大學西南醫院全軍肝膽外科研究所，重慶400038;河北保定市663部隊衛生隊)

離體肝切術由德國漢諾威器官移植中心的Pichlmaryr等首先提出，并于1988年為1例胃平滑肌肉瘤肝臟巨灶轉移的病人進行了全球首例體外肝切除自體余肝原位再植術［1］。由于自體肝移植技術為部分常規難以切除的肝膽腫瘤提供了新的治療手段，緩解肝移植供肝短缺問題，故國內一些大的肝移植研究中心開展了該項手術方式，并對其大動物模型進行了研究［2，3］，由于大動物成本高，不能進行大樣本量的系統研究，國內研究機構轉而進行對大鼠自體肝移植模型進行摸索［4－8］，但是，以往國內建立的自體移植模型出發點都在于研究缺血再灌注的損傷作用，未能將離體肝切除后小體積自體肝臟植入的繼發問題進行一并深入研究，所以我們認為大鼠離體肝切除聯合自體肝移植模型的建立很有必要。我們經過不斷的練習和改進，已成功地建立了穩定的大鼠離體肝切除聯合自體肝移植模型，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 手術器材 YBWZ-12型微量輸液泵，顯微手術器械包，9－0絲線圈。1 mm的硬膜外麻醉導管，兩端修剪成斜面。0.9%的氯化鈉注射液(每ml灌注液中含肝素50 U，地塞米松20 μg)，乳酸鈉林格液及直徑為5 cm的平皿。

1.2 動物模型制作 采用封閉群SD雄性大鼠，購自第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心，重200－250 g，實驗室清潔級飼養。60只大鼠全部術前禁食12 h，不禁水。大鼠術前0.5 h肌肉注射阿托品0.03 mg，乙醚吸入麻醉。

1.2.1 無損傷肝切取 取上腹部正中線直切口，劍突牽引，以自制拉鉤牽引雙側肋弓，置腰墊，將腸袢移至腹腔外左側，覆蓋鹽水紗布，遠離肝臟剪斷肝鐮狀韌帶、冠狀韌帶，游離并雙結扎離斷左膈下靜脈。游離門靜脈直至脾靜脈處，9－0絲線結扎幽門靜脈。分離膽道，距離左右肝管匯合部1.5 cm處楔形切開膽總管向內置入長4－5 mm、外徑1 mm的支架，9－0的絲線固定。剪開肝尾狀葉的韌帶和下腔靜脈以及腎靜脈表面的后腹膜及結締組織膜，將右腎靜脈至肝尾葉之間的下腔靜脈完全游離，肝尾狀葉后部穿線結扎右腎上腺靜脈。9－0絲線結扎肝固有動脈，上方切斷。檢查所需用具后，血管夾夾閉肝下下腔靜脈及門靜脈，進入無肝期計時，于幽門靜脈門靜脈斷端側內注入2 ml室溫0.9%的氯化鈉注射液(每毫升灌注液中含肝素50 U，地塞米松20 μg)將肝內血管床殘留血液驅回體循環。由左側膈下向右置入沙氏鉗，連同部分膈肌一起鉗夾，注意不要鉗夾肺組織并觀察大鼠呼吸及心跳情況。沿膈肌環剪斷肝上下腔靜脈，幽門靜脈斷端處剪斷門靜脈，肝尾狀葉與右腎靜脈之間剪斷肝下下腔靜脈。

1.2.2 肝臟灌注及肝葉切除 將切下的供肝放入備有0－4℃的乳酸林格氏液直徑為5 cm的平皿中，將套管針置入肝臟門靜脈斷端，9－0的絲線固定，以15 ml/h的速度注入4℃乳酸林格氏液5 min，沖洗肝臟并觀察是否有沖洗液由肝上及肝下下腔靜脈流出，直至肝臟變為土黃色。灌注同時按照Higgin’s法行70%肝臟大部分切除。

1.2.3 小體積肝自體肝移植 將30%剩余肝臟原位置入腹腔，在顯微鏡下用9－0的縫線單線連續縫合肝上下腔靜脈，同時用50 U/ml肝素生理鹽水充盈肝上下腔靜脈以避免血凝塊和氣泡。相同方法縫合門靜脈，松開門靜脈及肝上下腔靜脈的阻斷夾，結束無肝期，肝臟立即變紅。同法吻合肝下下腔靜脈，膽管支架套接法重建膽管、9－0絲線環扎固定。檢查腹腔內無活動性出血，血管、肝臟無扭曲后關腹，碘酒消毒切口。術后一般能自動翻身爬行，0.5 h后能飲水，12 h后開始進食。

1.2.4 術后管理及觀察 術后對大鼠進行復溫，保持室內溫度為25℃單獨置于籠中，自由飲用10%葡萄糖液，12 h后給予正常飲食。術后不予抗生素。術后前3 d精神略差，皮毛雜亂、進食減少、體重略下降，5 d后逐漸恢復正常。

2 結果

60只大鼠全部采用定型術式，肝上下腔靜脈縫合時間為(5.78±0.93)min，肝下下腔靜脈縫合時間為(4.91 ±1.14)min，門靜脈縫合時間為(4.86 ±1.07)min，肝臟冷灌注時間 5 min，無肝期(20.14 ±1.53)min。手術成功率 91.7%(55/60)，1 周以上存活率80%(48/60)。術后24 h內死亡的5例大鼠中，術后1 h內因失血性休克死亡2例，為肝上下腔靜脈后壁出血;1例因空氣栓塞而死亡;2例因為肝臟灌注速度過快肝臟損傷嚴重3 d后死亡。術后1周內死亡的7例大鼠中，2例因肝功能衰竭死亡，3例在第11天因膽道梗阻死亡，2例術后腹膽道支架連接處有膽漏、形成膽汁性腹膜炎而死亡。術后24 h內成活的55只大鼠于術后2，6，24 h尾靜脈抽血測肝功能，結果見表1。

表1 術后不同時間ALT和AST變化

3 討論

大鼠離體肝切除聯合自體肝移植模型不能僅僅當做大鼠肝切除模型和大鼠原位肝移植模型的簡單結合，在其操作過程中有其獨特的技術要點，自體肝移植直接限制了袖套技術的運用，導致所有離斷血管必須全部連續縫合，而肝門阻斷期間還需行肝臟灌注及大部分肝臟切除，大大提高了手術操作的難度。我們在不斷練習和改進的基礎上，建立了較穩定的大鼠肝移植模型。在實驗中我們有如下的體會:①術中腰墊及自制拉鉤的使用對手術視野的暴露極其重要，手術過程中根據不同的步驟調整腰墊及拉鉤的位置可以達到最佳的暴露效果。②肝上下腔靜脈上夾子時注意暴露出后壁膈肌，但不能夾得太多以免抑制呼吸;劍突牽拉力度要適中，如發現呼吸減慢，則先放松后再慢慢提起。③灌注要緩慢均勻，速度不宜過快，約維持在15 ml/h，灌注過快易于引起肝細胞水腫，灌注過慢則會引起灌注不足。經門靜脈灌注1 min即可發現肝臟顏色變淡。灌注時將肝臟置于4℃乳酸鈉林格液中，灌注滿意的肝臟無水腫并保持原有質感，呈土黃色，肝葉邊緣銳利。④下腔靜脈及門靜脈的吻合對顯微外科技術要求相當高，要求在針距基本相等，縫合組織不宜過多或過少的基礎上，保證吻合速度，不漏血漏氣且無狹窄。出針要沿縫針弧度，不可扯拉以免撕裂血管。

總之，建立穩定的大鼠離體肝切除聯合自體肝移植模型在自體肝移植術研究中具有重要作用，該模型可以單獨反映小體積肝臟缺血再灌注損傷以及繼發門靜脈高壓過程，而不用考慮移植免疫排斥反應;同時可以作為小體積異體肝移植的陰性對照研究。在不斷地練習和經驗總結中，對模型進行了很多細微的改進，明顯減少了人為操作失誤以及術后并發癥的發生，終于建立了穩定的大鼠離體肝切除聯合自體肝移植模型，為以后自體肝移植相關研究提供了有力的支持。

［1］ Pichlmaryr R，Rosse H，Hauss J，et al.Technique and preliminary results of extracorporeal liver surgery(bench procedure)and of surgery on the in situ perfused liver［J］.Br J Surg，1990，77(1):21－26.

［2］ 劉敦貴，周平，曾凡軍，等.半離體肝切除余肝自體再移植的研究［J］.中華實驗外科雜志，1997，14(2):102－103.

［3］ 董家鴻，蔡景修，段恒春，等.全肝血液轉流及冷灌注下的離體肝切除術:動物實驗和病例報告［J］.肝膽外科雜志，1997，5(4):209－213.

［4］ 馬凱，戴顯偉，王仁平，等.下腔靜脈內分流法大鼠自體原位肝移植模型的建立［J］.中國醫科大學學報，1998，27(4):356－358.

［5］ 趙宏峰，周杰.大鼠自體原位肝移植膽道缺血再灌注損傷模型的建立［J］.第二軍醫大學學報，2006，27(4):429－430.

［6］ 熊力，王玉柱，葉啟發，等.大鼠原位自體肝移植灌注模型的技術改良［J］.中國普通外科雜志，2008，17(7):716－717.

［7］ 蘇樹炎，霍楓.大鼠自體肝移植中三種不同肝臟灌注方法的比較［J］.肝膽胰外科雜志，2008，20(4):248－250.

［8］ 金成，張培建，馮敏，等.經門靜脈灌注法大鼠自體原位肝移植模型的建立［J］.中國普外基礎與臨床雜志，2009，16(3):184－186.

［9］ Kamada N，Calne RY.Orthotopic liver transplantation in the rat.Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage［J］.Transplantation，1979，28(1):47－50.