渥曼青霉素對(duì)大鼠腦外傷誘導(dǎo)的凋亡損害的影響

陳 曄，林 凌，俞向梅，林 棟 (福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院解剖學(xué)教研室，福州 35008;福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院)

腦外傷是一種死亡率極高的神經(jīng)損傷，而凋亡對(duì)腦外傷后持續(xù)性的神經(jīng)細(xì)胞死亡起著重要作用［1］。體內(nèi)外研究表明，機(jī)械損傷可引起Akt磷酸化增多，激活PI3K-Akt通路而增加神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與caspase-3的表達(dá)有關(guān);應(yīng)用PI3K阻斷劑LY294002可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，PI3K信號(hào)通路可能參與其作用機(jī)制［2，3］。渥曼青霉素(wortmannin)是一種常用的PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)特異性抑制劑［4］，可以通過(guò)細(xì)胞膜與胞內(nèi)PI3K的110 kD催化亞基相結(jié)合，特異性抑制PI3K及PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減輕細(xì)胞凋亡［4］。而目前關(guān)于渥曼青霉素治療腦外傷機(jī)制與PI3K/Akt、細(xì)胞凋亡的關(guān)系，仍需不斷深入研究。本實(shí)驗(yàn)觀察wortmannin對(duì)機(jī)械性腦外傷誘導(dǎo)的腦細(xì)胞凋亡的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性Wistar大鼠100只，體重250－300g(由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

1.2 藥品與試劑 β-actin(A5441，Sigma產(chǎn)品);ECL顯色劑(Lot#47，Amersham Biosciences產(chǎn)品);wortmannin(19545－26－7;Aladdin產(chǎn)品);Kodak XOmat BT膠片(Lot#038321804，Kodak產(chǎn)品);BCA蛋白分析試劑盒(Lot#EF60975，Pierce產(chǎn)品);caspase-3(sc-1224，Santa Cruz產(chǎn)品)，Bcl-2(04－436，Millipore產(chǎn)品)。

1.3 方法

1.3.1 建立大鼠腦外傷模型(TBI) 將大鼠隨機(jī)分為三組，分別為假手術(shù)組(sham組)20只、手術(shù)對(duì)照組(saline組)40只與手術(shù)治療組(wortmannin組)40只。采用改良自由落體法建立大鼠腦外傷模型。sham組暴露硬腦膜而不撞擊，wortmannin組打擊前左側(cè)腦室注射5 μl wortmannin，saline組造模前注射5 μl生理鹽水。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，各組又分為24 h、48 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，保證每組中2個(gè)時(shí)間點(diǎn)上有5只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重復(fù)。每組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取5只大鼠，以備進(jìn)行免疫印記與real-time PCR等分子檢測(cè)，同樣保證各組各時(shí)間點(diǎn)有5只大鼠進(jìn)行缺損體積檢測(cè)，考慮動(dòng)物實(shí)驗(yàn)樣本脫落、剔除、造模成功率等因素，故增加至總動(dòng)物樣本數(shù)100只。

大鼠稱重后用4%水合氯醛(0.1 ml/100 g)腹腔麻醉，固定于動(dòng)物腦立體定位儀上，頭部剪毛消毒，于頭皮正中切開(kāi)，切口長(zhǎng)4 cm，剝離右側(cè)顱頂骨膜，用骨鉆于冠狀縫后及中線旁各3 mm處鉆一直徑約1 cm的骨窗，暴露硬腦膜并使其完整。打擊前左側(cè)腦室注射5 μl wortmannin(50 nmol/L，5 min 注完)，依據(jù)文獻(xiàn)［3］應(yīng)用改良自由落體法，使用40 g砝碼從20 cm高處墜落，撞擊于硬腦膜表面上的圓柱體。撞擊硬腦膜的圓柱體直徑1 cm，撞擊時(shí)以圓柱體下降小于2 mm為限。建立腦外傷模型，記錄打擊時(shí)間，逐層消毒以預(yù)防創(chuàng)口感染，縫合頭皮。保證每次的打擊力度與損傷程度一致。假損傷組僅切開(kāi)頭皮、右頂部開(kāi)骨窗，不致腦外傷。在腦外傷后24 h或48 h分別將大鼠麻醉后斷頭處死，取損傷側(cè)皮質(zhì)樣本，分別做免疫印記與Real-time PCR。同時(shí)，在腦外傷后7 d，分別將 sham組、saline組與wortmannin組(各組5只)大鼠麻醉斷頭處死后，取腦組織做冰凍切片。

1.3.2 Western blot檢測(cè) 提取損傷皮質(zhì)蛋白質(zhì)樣本，將取好的樣本置于300 μl細(xì)胞裂解液中，超聲細(xì)胞破碎儀低溫勻漿。10 000 r/min 4℃離心10 min，取上清。取1 μl蛋白液，BCA法測(cè)蛋白含量，用細(xì)胞裂解液將上樣蛋白濃度調(diào)成一致。樣品按4∶1加入5×上樣緩沖液，混勻后95℃變性5 min。10%SDS-PAGE電泳，電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，分別加入 caspase-3(1∶500)，Bcl-2(1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜，洗膜后再用HRP標(biāo)記的二抗雜交，37℃，3 h，ECL試劑X線膠片顯像，掃描，以與β-actin的比值作為表達(dá)強(qiáng)度［5］。

1.3.3 Real-time PCR檢測(cè) 腦外傷后24 h，取損傷側(cè)腦海馬組織，對(duì)所有樣本立即進(jìn)行總RNA的抽提，抽提操作按照Beyozol說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行。用NanoDrop 1000分光光度計(jì)測(cè)定所抽提RNA在260 nm和280 nm處的光密度(OD)及質(zhì)量密度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。

反轉(zhuǎn)錄:取RNA樣品500 ng進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照Prime-ScriptTMRT試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系。反應(yīng)體系為 20 μl，條件為:37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，1個(gè)循環(huán)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR:取上述反轉(zhuǎn)錄液1 μl，實(shí)時(shí)熒光定量PCR按照SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行。BAX:上游引物5'－GCA TCC ACC AAG AAG CTA AG－3'，下游引物5'－CAA AGT AGA AGA GGG CAA CC－3';β-actin:上游引物5'－TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACGA－3'，下游引物5'－CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATGG－3'。

DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè):將皮質(zhì)基因組DNA分離，并置于2%的瓊脂糖凝膠中電泳。皮質(zhì)組織樣本置以下緩沖液中處理:100 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.5%SDS，和 0.5 mg/L RNase A。將組織勻漿置60℃中孵育3 h加入0.6 mg蛋白酶K后繼續(xù)過(guò)夜孵育。DNA通過(guò)苯∶氯仿∶異戊醇(24∶25∶1)標(biāo)準(zhǔn)操作方法來(lái)萃取。將DNA置于2%的瓊脂糖凝膠中電泳，染上EB后通過(guò)UV transluminator來(lái)檢測(cè)，并通過(guò) Gel Document 2000(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)來(lái)顯影。

1.3.4 缺損體積檢測(cè) 打擊前左側(cè)腦室分別注射5 μl生理鹽水及藥物，7 d后斷頭取腦，切片迅速放入液氮罐中速凍15 s，再移入冰凍切片機(jī)，取各組相同斷面(分8個(gè)斷面，每個(gè)斷面為250 μm，切片厚度為12 μm)進(jìn)行連續(xù)切片，用蘇木精染色，沖洗玻片。每張切片經(jīng)等倍放大，用光電子VI-470 CCD相機(jī)進(jìn)行圖像采集，對(duì)腦片缺損區(qū)域進(jìn)行邊界提取，將提取圖像導(dǎo)入圖像處理軟件并根據(jù)設(shè)定參數(shù)進(jìn)行體積計(jì)算。用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，同時(shí)測(cè)量每張切片的同側(cè)皮質(zhì)總的區(qū)域，用Cavalieri方法來(lái)確定損傷皮質(zhì)體積和整個(gè)皮質(zhì)體積［3］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，3組以上采用單因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)并進(jìn)行多組間差異性統(tǒng)計(jì)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Caspase-3蛋白表達(dá)變化 Caspase-3有兩條帶，分別為前體型 Caspase-3與激活型 Caspase-3。與sham組相比，saline組腦外傷后24 h和48 h激活型Caspase-3(Actin-Caspase-3)蛋白水平明顯升高(P＜0.01);與 saline相比，wortmannin能明顯抑制腦外傷引起Caspase-3的激活(P＜0.01，見(jiàn)圖1)。

圖1 Caspase-3蛋白表達(dá)情況Fig 1 Expression of caspase-3 protein

2.2 Bcl-2蛋白表達(dá)變化 與sham組相比，腦外傷后24 h與48 h檢測(cè)到Bcl-2蛋白水平明顯下降(P＜0.01)。與saline相比，wortmannin預(yù)防性給藥后明顯抑制腦外傷引起B(yǎng)cl-2的降低(P＜0.01，見(jiàn)圖2)。

圖2 Bcl-2蛋白表達(dá)情況Fig 2 Expression of Bcl-2 protein

2.3 Real-time PCR 檢測(cè)

2.3.1 總RNA純度及完整性檢測(cè) 將所提取的總RNA用2 0 μl DEPC水溶解。測(cè)得所有樣本的OD260/OD280均在1.8－2.0，質(zhì)量濃度為 500－3 000 ng/μl。瓊脂糖凝膠電泳顯示如下所示，rRNA占總RNA的80%－85%，在瓊脂糖凝膠上可以清晰地看到28S和18S rRNA，28S rRNA的量約為18S rRNA的2倍，說(shuō)明所有樣本的完整性良好(見(jiàn)圖3)。

圖3 總RNA純度及完整性情況Fig 3 Purity and integrity of total RNA

2.3.2 Bax mRNA定量測(cè)定 對(duì)所提取的RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR定量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果用循環(huán)閾值(Ct值)表示，見(jiàn)表1。

表1 熒光定量PCR定量檢測(cè)結(jié)果Tab 1 Real-time PCR results of Bax mRNA

2.3.3 熒光定量PCR定量檢測(cè) 與sham組相比，saline組的Bax mRNA循環(huán)次數(shù)升高(P＜0.05)。而與saline組相比，wortmannin組Bax mRNA循環(huán)次數(shù)明顯低于 saline組(P＜0.05)，表明 wortmannin能抑制腦外傷引起的Bax mRNA表達(dá)增高(見(jiàn)圖4)。

圖4 Bax mRNA熒光定量PCR分析結(jié)果Fig 4 PCR results of Bax mRNA

2.4 DNA瓊脂糖凝膠電泳觀察 腦外傷后24 h凋亡條帶可以明顯檢測(cè)到，wortmannin預(yù)防性給藥后能明顯減輕腦外傷引起的核DNA片段斷裂(見(jiàn)圖5)。

圖5 DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig 5 Agarose gel electrophoresis of DNA fragement

2.5 腦組織損傷體積檢測(cè) 與sham組(未見(jiàn)腦組織損傷)比較，saline組擊打處局部腦組織的損傷體積增大，但與saline組相比，wortmannin給藥后能明顯減小局部腦組織的損傷體積(見(jiàn)圖6)。

3 討論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)顱腦損傷(TBI)的發(fā)病率及死亡率日趨增高，腦外傷可誘發(fā)腦組織酸中毒及微循環(huán)障礙、細(xì)胞壞死和凋亡等一系列的病理生理變化［4］。現(xiàn)代研究表明，細(xì)胞凋亡和抗凋亡機(jī)制、自由基介導(dǎo)的DNA氧化損傷和DNA自身修復(fù)能力的變化等可能在顱腦損傷后的細(xì)胞損害中扮演重要角色［6］。

圖6 腦組織損傷體積檢測(cè)Fig 6 Observation of brain lesion volume

細(xì)胞壞死和凋亡是外傷性TBI的重要機(jī)制之一，PI3K-Akt信號(hào)通路在介導(dǎo)大腦細(xì)胞凋亡中起主導(dǎo)作用之一。近年來(lái)體內(nèi)外研究均表明中樞神經(jīng)損傷時(shí)細(xì)胞凋亡增加，同時(shí)可見(jiàn) PI3K/Akt、MEK/ERK1/2通路激活，Bcl-2與Bax比例失調(diào)，抗凋亡Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Caspase-3表達(dá)增加，而通過(guò)上游PI3K抑制可減輕神經(jīng)細(xì)胞死亡［7－12］，此外某些藥物如胰島素可通過(guò)介導(dǎo)PI3K-Akt途徑發(fā)揮其抗凋亡作用［13］。

渥曼青霉素(WT)是磷脂酰肌醇3－激酶的一種特異性抑制劑，可減輕各種臟器損傷［14－16］(如腎臟缺血再灌注損傷、大鼠腸道外傷性出血及肝臟損傷等)，通過(guò)(PI3K)/PKB信號(hào)通路可延遲熱損傷引起的中性粒細(xì)胞凋亡［17］，此外可減輕局部腦缺血損傷［18］，抑制蛛網(wǎng)膜下隙出血導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡等［19］。

caspase-3以酶原形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞凋亡早期被激活，常作為早期細(xì)胞凋亡的指標(biāo)，活化的caspase-3由2個(gè)大亞基(17 kD)和2個(gè)小亞基(12 kD)組成，可裂解相應(yīng)的底物，尤其是特異性地水解DEVD-X肽類和D-X肽鍵的底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生［20］。Bcl-2家族可以分為兩大類:一是抗凋亡的，主要有Bcl-2、Bcl-XL等;二是促細(xì)胞凋亡的，主要包括Bax、Bad、Bid等。Bcl-2可能是通過(guò)抑制谷胱甘肽(GSH)的外泄，降低胞內(nèi)的氧化還原電位，來(lái)抑制細(xì)胞凋亡的，而 Bax的作用則相反［21］。本實(shí)驗(yàn)研究表明，wortmannin均可在腦外傷損傷后24 h及48 h，減少Caspase激活，提高Bcl-2蛋白水平，并可減輕腦外傷引起的核DNA片段斷裂、缺損體積增大等不良情況，其抗凋亡機(jī)制可能是與PI3K-Akt-caspase-3途徑參與有關(guān)。

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