銀杏提取物對自身免疫性腦脊髓炎小鼠脫髓鞘免疫炎性病變的影響

陸 利，張衛國，楊桂姣 (山西醫科大學解剖教研室，太原 030001;通訊作者，E-mail:ygjshanyi@163.com)

銀杏提取物(ginkgo biloba extract，GBE)是以銀杏為原料，分離純化提取的物質，其主要活性成分是黃酮類和萜內酯類。以往研究顯示，GBE具有消除自由基、擴張冠狀血管和改善微循環的功效［1］。近期的研究證實GBE能夠抑制炎癥細胞因子的釋放，對免疫炎性疾病具有良好的預防和治療作用［2］。多發性硬化(multiple sclerosis，MS)是以神經纖維髓鞘脫失和軸突潰變為主要病理特征的一種慢性炎性疾病，目前臨床治療尚無肯定而有效的措施。本研究應用MS經典動物模型—實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠，觀察 GBE對 EAE小鼠的影響，探討GBE延緩脫髓鞘病變的可能及作用機制，以期為GBE的臨床應用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器 雄性C57BL/6小鼠40只，8周齡，體重18－20 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。髓鞘少突膠質細胞糖蛋白33－55(MOG33－55，純度 HPLC ＞96%)由北京奧科生物技術有限公司合成，完全弗氏佐劑(CFA)和百日咳毒素(PTX)購自Sigma公司，GBE由石家莊神威藥業有限公司提供，CD4一抗購自美國Chemicon公司，生物素標記羊抗小鼠二抗和SABC試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。恒冷箱切片機德國Leica公司，光學顯微鏡日本Olympus公司，酶標儀美國Bio-rad公司。

1.2 動物模型制備與分組 將實驗動物分為GBE組和EAE組:GBE組(n=20)于造模前7 d開始每日腹腔注射GBE 70 mg/kg，連續40 d;EAE組(n=20)于造模前7 d開始每日腹腔注射等體積0.9%生理鹽水，連續40 d。EAE模型制備參照文獻［3］，小鼠背部中線兩側皮下4點注射MOG33－55與CFA混合乳化抗原制劑，免疫當天及第2天給予小鼠腹腔注射PTX，誘導小鼠產生EAE。

1.3 神經功能評分 免疫后每日觀察動物進行神經功能評分，評分標準按照參考文獻［4］:0分，正常，未發病;1分，鼠尾張力障礙;2分，部分后肢癱瘓或步態不穩;3分，完全后肢癱瘓;4分，部分或完全前肢癱瘓;5分，瀕死狀態或死亡。

1.4 組織標本制備與免疫組化染色 選取免疫21 d后EAE組和GBE組小鼠各5只，經水合氯醛過度麻醉后，從心臟灌注生理鹽水和4%多聚甲醛固定液，隨后斷頭取腦室溫后固定2 h，移置30%蔗糖溶液4℃保存。Leica恒冷箱切片機進行連續矢狀切片、片厚16 μm，裱片于多聚賴氨酸包被的清潔載玻片上。免疫組化染色按照試劑盒說明操作。腦組織切片經0.3%H2O2孵育5 min滅活內源性過氧化物酶，CD4一抗稀釋液4℃孵育過夜，次日依次加入生物素化羊抗小鼠二抗以及SABC復合物作用1 h，DAB顯色10 min，酒精梯度脫水、二甲苯透明后封片。

1.5 酶聯免疫吸附實驗(ELISA) 選取免疫后第21天EAE組和GBE組小鼠各5只，斷頭處死動物，切取大腦前極至視交叉處腦組織約100 mg，加入預冷的裂解液冰上研磨，10 000×g離心15 min收集上清液，應用BCA法測定蛋白濃度。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測TNF-α和IL-2含量。

2 結果

2.1 神經功能評分 小鼠免疫后第8－15天相繼發病，第21－26天發病達到高峰。患病小鼠表現為活動減少，進食量下降，弓背、尾部拖垂，步態蹣跚，后肢無力，嚴重者肢體完全癱瘓。GBE組小鼠發病潛伏期為(12.5 ±0.64)d，較 EAE 組的(10.7 ±0.47)d顯著延長(P＜0.05)。GBE組小鼠各時間段神經功能評分均低于EAE組，其中發病高峰期(免疫后第21天)二者神經功能評分差異具有統計學意義(圖1)。GBE組小鼠未出現肢體完全癱瘓的嚴重癥狀，表明GBE能夠緩解EAE小鼠臨床癥狀。

圖1 不同時間段小鼠神經功能評分Fig 1 The mean clinical scores of mice at each time point

2.2 海馬傘CD4免疫組化染色結果 海馬傘由傳出和傳入海馬的纖維組成，屬于中樞神經系統白質。選取同一矢狀切面海馬傘標本，進行CD4免疫組化染色，觀察GBE對EAE小鼠T淋巴細胞增殖反應的影響(圖 2)。結果顯示 EAE組CD4+T淋巴細胞較多，免疫陽性細胞聚集成簇，而GBE組CD4+T淋巴細胞較EAE組明顯減少，僅可見CD4+T淋巴細胞散在分布，提示GBE能夠抑制CD4+T淋巴細胞激活和增殖。

圖2 海馬傘CD4免疫組化染色(×200)Fig 2 The immunohistochemistry staining of CD4 in the fimbria of hippocampus(×200)

2.3 ELISA檢測TNF-α和IL-2 ELISA定量分析結果顯示，GBE組發病高峰期腦組織中TNF-α含量較EAE組明顯減少(P＜0.05)，但是IL-2的含量兩組之間的差異無統計學意義。提示GBE治療后能夠抑制中樞神經系統TNF-α的釋放。

表1腦組織中TNF-α和IL-2含量比較(ng/mg，±sˉx)Tab1 Comparison of the level of TNF-α and IL-2 in the brain(ng/mg，±sˉx)

表1腦組織中TNF-α和IL-2含量比較(ng/mg，±sˉx)Tab1 Comparison of the level of TNF-α and IL-2 in the brain(ng/mg，±sˉx)

與 EAE 組比較，*P ＜0.05

組別 TNF-αIL-2 EAE組2.03 ±0.11 11.76 ±0.76 GBE 組 1.67 ±0.10*9.89 ±0.50

3 討論

GBE是從銀杏葉中分離純化的物質，含銀合內酯和銀合黃酮甙等成分，具有清除氧自由基、抗脂質過氧化和保護血管內皮細胞等作用。近年來有報道證實GBE能夠調解免疫細胞的功能狀態，并能抑制各種細胞因子和炎性介質的過度釋放，預防和治療自身免疫炎性疾病［5］。EAE是研究炎性脫髓鞘MS免疫發病機制的經典模型，梁戰華等［6］觀察了GBE對豚鼠EAE模型的影響，發現與模型組相比GBE治療組EAE發病推遲、病情減緩。我們的研究結果也顯示GBE組小鼠發病潛伏期較EAE組顯著延長約2 d，發病高峰期GBE組小鼠神經功能評分顯著降低，并且GBE組小鼠未出現肢體完全癱瘓的嚴重癥狀，表明GBE對EAE小鼠具有保護作用，能夠緩解EAE小鼠臨床癥狀。

MS是中樞神經系統脫髓鞘疾病，免疫調節異常在其發生和發展過程中發揮著重要作用。淋巴細胞尤其是T淋巴細胞是MS發病過程中的主要效應細胞，MS患者急性期和復發期，腦和脊髓實質中出現大量T淋巴細胞局灶性浸潤，活化的T淋巴細胞聚集于脫髓鞘病灶血管周圍，轉移活化T淋巴細胞至動物體內能夠誘導產生EAE［7］。此外，MS患者體內T淋巴細胞亞群失衡，主要表現為外周血及腦脊液中CD4+T淋巴細胞升高，CD8+T淋巴細胞降低，CD4+/CD8+比值升高。激活的CD4+T細胞在外周血不斷增生并表達各種細胞表面黏附因子，穿越血腦屏障進入中樞神經系統對髓鞘堿性蛋白或脂蛋白產生攻擊，若阻斷或抑制CD4+T細胞能夠防止疾病復發和進展［8］。本研究結果顯示 EAE組CD4+T淋巴細胞數量較多、細胞聚集成簇，而GBE治療組僅可見 CD4+T淋巴細胞散在分布，提示GBE可能通過抑制CD4+T淋巴細胞激活和增殖從而下調免疫炎癥反應，保護髓鞘結構。

既往的研究結果顯示激活的CD4+T淋巴細胞進入中樞神經系統與腦內抗原呈遞細胞相互作用，分泌TNF-α、IL-2、IL-6和NO等一系列炎性細胞因子和細胞毒性物質，啟動或促進MS進程［9］。TNF-α在EAE炎性脫髓鞘發病機制中扮演重要角色，TNF-α不但能夠刺激單核巨噬細胞產生炎性介質，而且還能直接殺傷少突膠質細胞，使髓鞘形成障礙。另外，TNF-α還可以誘導內皮細胞產生黏附分子，促進外周血單個核細胞穿過血腦屏障，加重EAE的病情，TNF-α的生物活性與EAE病情嚴重程度相平行［10］。本研究結果顯示，GBE組腦組織 TNF-α含量較EAE組顯著降低，表明GBE可能通過減少TNF-α的釋放，抑制炎癥反應，從而減輕免疫系統對自身組織的攻擊，保護少突膠質細胞。本次研究未檢測出GBE對IL-2含量的影響，有關GBE對其他細胞因子的作用及其潛在的作用機制尚待進一步研究。

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