銀杏愈傷組織誘導初步研究

張威威 秦公偉 程水源 許 鋒

(長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434025) (陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000) (黃岡師范學院生命科學與工程學院，湖北 黃岡 438000) (長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434025)

銀杏愈傷組織誘導初步研究

張威威 秦公偉 程水源 許 鋒

(長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434025) (陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000) (黃岡師范學院生命科學與工程學院，湖北 黃岡 438000) (長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434025)

以銀杏(Ginkgobiloba)的嫩葉為外植體，以MS為基本培養基，探討了6-BA、KT及NAA不同配比組合在愈傷組織誘導中的作用。結果表明，MS+NAA 2 mg/L+KT 0.1 mg/L培養基誘導的銀杏愈傷組織生長量多，呈淺黃綠色、顆粒化明顯、排列疏松，效果較好。

銀杏(Ginkgobiloba)；培養基；愈傷組織

銀杏(Ginkgobiloba)是現有種子植物中最古老的孑遺植物，又稱“活化石”。銀杏壽命長，又名“公孫樹”。它原產中國，具有極高的經濟、生態、觀賞和科研價值，尤其是銀杏體內化學物質黃酮、帖內酯的藥用價值[1]，已受到世界范圍內研究者日益廣泛的關注。

通過組織培養獲取大量細胞，從中提取黃酮、銀杏帖內酯等藥用成分，不僅可以人為控制培養條件，選擇優良細胞系得到較高含量的代謝產物，還具有速度快，周期短，效率高等特點。上世紀30年代以來，國內外學者先后開展了銀杏配子體、胚、葉片、莖段等外植體培養研究。各種外植體在一定條件下已誘導出愈傷組織，但有關影響銀杏愈傷組織培養因子研究報道較少[2，3]。本研究通過對培養基、激素種類和濃度等培養條件進行了初步探討，以期尋求一種適合銀杏愈傷組織誘導的方法，為銀杏生物技術研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

銀杏葉采自長江大學銀杏科技園，銀杏品種為10年生家佛手，樹勢良好，生長正常。

1.2方法

(1)愈傷誘導培養基的篩選 采用的培養基為：①MS+NAA 2 mg/L+KT 1 mg/L；②MS+NAA 2 mg/L+KT 0.1 mg/L；③MS+NAA 2 mg/L+6-BA 1 mg/L。

(2)愈傷組織誘導 將剛采集的銀杏嫩葉先用自來水沖洗干凈，經蒸餾水漂洗，裝入廣口瓶放入超凈工作臺，加入體積分數為75%的乙醇溶液滅菌約10 s，傾倒掉乙醇后，材料轉入質量分數0.1%的升汞溶液中消毒8～10 min，完成后立即用無菌水沖洗3～4次[4,5]。夾取嫩葉，在滅菌培養皿內無菌濾紙上，將材料切分成3～5 mm的小塊，分別接種在準備好的培養基上；每瓶接種4塊，每種培養基接種60瓶。

(3)培養條件 每天光照12 h左右，光照強度2 000 lx，溫度控制在(28±1)℃，相對濕度60%～75%。

(4)指標計算方法 分別按下述公式計算成活率、污染率、死亡率和愈傷組織誘導率。

成活率(%)=(未污染未壞死外植體數/接種外植體個數)×100%；

污染率(%)=(污染外植體數/接種外植體個數)×100%；

死亡率(%)=(壞死外植體數/接種外植體個數)×100%；

愈傷組織誘導率(%)=(再生愈傷團數/接種外植體個數)×100%。

2 結果與分析

2.1培養基接種效果

外植體接種到培養基上，在設定的培養條件下光照培養。一周左右長出愈傷組織，數量不斷增多，體積膨大，顆粒化逐漸出現。培養基接種后生長狀況統計結果見表1。

表1 培養基接種效果

2.2愈傷誘導培養基的篩選

將銀杏嫩葉消毒后接種在三種愈傷組織誘導培養基上光照培養。銀杏嫩葉所誘導的愈傷組織的生長周期約為30 d左右，其生長延緩期約為10 d，第10至25 d為快速生長期，25 d后進入穩定期，穩定期過后，愈傷組織很快衰老，變褐死亡。在愈傷組織誘導培養基的篩選試驗中，圖1是在接種后第15 d的愈傷組織生長效果。

從圖1中可知，①號培養基誘導的愈傷組織淡綠色、生長量少、顆粒化不很明顯；②號培養基誘導的愈傷組織淺黃綠色、生長量多、顆粒化明顯、排列疏松；③號培養基誘導的愈傷組織綠色、生長量多、顆粒化不明顯、排列緊密。結果表明，在相同種類水平生長素(NAA 2 mg/L)，相同種類較低水平細胞分裂素(KT ①號培養基1 mg/L，②號培養基0.1 mg/L)有利于愈傷組織生長，顆粒化；不同種類相同水平細胞分裂素(①號培養基KT 1 mg/L，③號培養基6-BA 1 mg/L)，6-BA有利于愈傷組織生長，但顆粒化不明顯，細胞排列密實；綜合比較三種培養基上愈傷組織生長狀況，②號培養基MS+NAA 2 mg/L+KT 0.1 mg/L比較適合銀杏嫩葉愈傷組織的誘導，所得愈傷組織相對較好，適合進一步后期的繼代培養或者細胞懸浮培養研究。

圖1 不同培養基誘導的愈傷組織

3 討論與小結

植物生長所需要的培養基成分包括碳源、大量元素、微量元素、鐵鹽、有機成分和植物生長調節劑。因各種植物對營養成分的需要不同，培養基中各組分的濃度和不同組合，將對植物的生長產生不同的影響。為了選擇銀杏愈傷組織誘導生長的最適培養基，本試驗參考于榮敏等[6]、曉原等[7]和楊林等[8]的研究結果，在以往的研究基礎上，進一步分析了6-BA、KT、及NAA三種激素不同配比組合在愈傷組織誘導中的作用；通過培養基的篩選誘導愈傷組織，獲得了生長速度快、顆粒化好、疏松的愈傷組織，得到的銀杏嫩葉愈傷組織誘導最適培養基為MS+NAA 2 mg/L+KT 0.1 mg/L，與于榮敏等[6]的研究結果相近。

[1]龐 允，楊建秀，劉子蘭.銀杏葉中黃酮的提取工藝比較[J].制劑技術，2007，16(3)：38～39.

[2]Tulecke W R. A tissue derived from the pollen ofGinkgobiloba[J]. Science. 1953，117: 559～600.

[3]羅紫娟.銀杳組織培養的韌步研究[J].云南植物研究，1984，6(1)：93～97.

[4]王德強，王曉玲.銀杏細胞的懸浮培養研究[J].食品與生物技術學報，2005，24(3)：27～29.

[5]郭 勇，崔堂兵，謝秀禎.植物細胞培養技術與應用[M].北京：化學工業出版社，2004.7.

[6]于榮敏，趙鴻蓮，張 輝，等.銀杏細胞懸浮培養及其銀杏內酯產生的研究[J].生物工程學報，1999，15(2)：207～210.

[7]曉 原，曹有龍.外部因子條件對麻黃細胞懸浮培養的影響[J].寧夏農學院學報，2001，22(3)：48～52.

[8]楊 林，周吉源.銀杏細胞懸浮培養及黃酮的產生[J].中央民族大學學報(自然科學版)，2002，11(1)：55～58.

10.3969/j.issn.1673-1409.2011.01.085

Q813.1;Q949.64

A

1673-1409(2011)01-0237-03

2010-09-21

國家自然科學基金項目(31000904)；湖北省教育廳高校產學研合作項目(XY2009B009)；湖北省自然科學基金項目(2009CDB232)；長江大學校基金項目(2006Z2073)

張威威(1981-)，男，河南周口人，碩士生，研究方向為分子生物學.

許 鋒，E-mail：xufeng198@126.com.