胰腺癌MiaPaCa-2細胞總RNA體外轉染樹突細胞的方法探討

陳江 郭曉鐘

·論著·

胰腺癌MiaPaCa-2細胞總RNA體外轉染樹突細胞的方法探討

陳江 郭曉鐘

目的探討將胰腺癌MiaPaCa-2細胞總RNA轉染樹突細胞(DCs)最優化的方法。方法以rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α聯合誘導外周血單核細胞以獲得DCs，觀察DCs的形態變化，流式細胞術檢測DCs表面標志CD40、HLA-DR、CD83和CD86表達，混合淋巴細胞反應(MLR)測定DCs刺激異體T細胞增殖的能力。采用脂質體轉染、電穿孔及被動轉染三種方法將MiaPaCa-2總RNA轉染DCs，應用實時定量PCR法檢測MUC1 mRNA表達，MTT法測定DCs存活率。結果所獲細胞具有典型的成熟DCs形態特征，CD40、HLA-DR、CD83和CD86陽性表達率分別為34.3%、50.2%、89.2%和73.6%，對同種異體T淋巴細胞具有極強的刺激增殖作用。電穿孔法DCs轉染48 h后， DCs的MUC1 mRNA表達量為45.39±9.33，明顯高于脂質體法的31.68±7.25和被動轉染法的18.53±3.26；DCs存活率為(80.36±2.43)%，較被動轉染法的(91.48±5.42)%略低，但高于脂質體法的(67.44±2.51)%，且基本穩定在80%左右。結論采用電穿孔法將胰腺癌MiaPaCa-2細胞總RNA體外轉染DCs的效率較高，且較安全。

胰腺腫瘤； 樹突細胞； RNA轉染

樹突細胞(dendrtic cells, DCs)腫瘤疫苗在抗腫瘤免疫治療中的作用正受到學界的廣泛關注，已開展的幾項早期臨床研究證實，其對多種類型腫瘤有顯著的治療效果[1]。構建DCs腫瘤疫苗的關鍵點之一在于腫瘤抗原負載方式的選擇，而近年來出現的RNA轉染DCs構建腫瘤疫苗的方法在臨床應用方面獨具優點[2]。然而迄今為止尚無胰腺癌細胞這方面的報道。本研究通過觀察胰腺癌細胞株MiaPaCa-2的MUC1表達和DCs存活率的變化，探索RNA轉染DCs的最優方法，為胰腺癌腫瘤疫苗構建和臨床應用提供實驗依據。

材料和方法

一、胰腺癌細胞總RNA提取及DCs培養、鑒定

人胰腺癌細胞株MiaPaCa-2為沈陽軍區總醫院消化科實驗室保存。將其接種于含10%小牛血清的RPMI 1640培養液中常規培養，選用對數生長期的細胞，采用Trizol提取細胞總RNA備用。

取20例健康志愿者和8例胰腺癌患者外周血，均獲得志愿者和患者的知情以及醫院倫理委員會的同意。通過Ficoll-paqueTplus密度梯度離心法分離獲取單核細胞(MCs)，常規培養。待細胞貼壁1 h后，取出未貼壁的細胞另做培養備用外，更換新鮮培養液繼續培養20 h，加入rhGM-CSF(800 IU/ml)和rhIL-4(500 IU/ml)再培養5 d后加入TNF-α(10 ng/ml)，培養至第10天，收集成熟DCs。使用倒置顯微鏡和電鏡連續觀察體外培養5～10 d的DCs的形態學變化。收集DCs，分裝5管，分別加入鼠抗人CD40、HLA-DR、CD83、CD86熒光單抗和作為對照的熒光標記的同種型IgG(Santa-Cruz，USA)，用流式細胞儀分析，每個樣品分析細胞數>1×106。

二、DCs刺激同種異體T細胞增殖能力的檢測

采用混合淋巴細胞反應(MLR)方法。以成熟DCs作為刺激細胞，以異體未貼壁的MCs作為反應細胞，按照刺激與效應細胞1∶10、1∶20、1∶40、1∶80和1∶160比例分別加入到96孔板中，終體積200 μl，以同種同體T細胞+DCs作為對照組。在37℃、5%CO2培養箱孵育5 d，收獲細胞前18 h每孔加入3H-TdR(中科院原子能所)1 μCi，采用液閃爍儀檢測每分鐘脈沖數(CPM)。

三、MiaPaCa-2細胞總RNA轉染DCs

收集的DCs經洗滌后，采用Opti-MEM重懸，調節DCs濃度為2×106/ml。取3 μg MiaPaCa-2細胞總RNA加入1 ml DCs中，而后分別參考Kalady等[3]的脂質體轉染法和Fujii等[4]的電穿孔法及被動轉染方法，將混合細胞于37℃、5% CO2培養箱孵育0、12、24、48、72、96 h。

四、RNA轉染后DCs的MUC1 mRNA表達檢測

采用實時定量RT-PCR(QRT-PCR)檢測。應用Primer premier 5.0軟件設計MUC1及次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)引物，并經Gene bank驗證。MUC1上游5′-TGAGTGATGTGC-3′，下游5′-CTG-CCCGTAGTTCTTTCG-3′，擴增產物158 bp；HPRT上游5′-GGTTCTCGGGGCACCTCT-3′，下游5′-TCGGCTTGAAATGACCTAATG-3′，擴增產物221 bp。收集使用3種方法轉染0～96 h的DCs 1×106個，采用Trizol提取細胞總RNA。按Sensiscript RT Kit(Qiagen，Germany)說明書行RT反應。在Exicycler 96定量PCR儀(South Korea)上，按照QuantiTect SYBR Green PCR Kit(Qiagen，Germany)說明書行PCR。反應條件：95℃ 15 min，94℃ 20 s、60℃ 20 s、72℃ 20 s， 40個循環，最后68℃ 60 s。用雙標準曲線法依據公式F=(待測樣品目的基因濃度/待測樣品看家基因濃度)/(對照組目的基因濃度/對照組看家基因濃度)[5]，對MUC1 mRNA進行相對定量，每個樣品重復2次，取均值。

五、DCs存活率檢測

將采用三種方法轉染MiaPaCa-2細胞總RNA的DCs接種在96孔板上，調整細胞濃度(5×106～10×106)/ml，體積180 μl，培養0、12、24、48、72、96 h，加入MTT 20 μl，37℃孵育4 h。棄上清液，每孔加DMSO 100 μl，震蕩10 min，酶標儀測A490值，以未轉染DCs作為對照。細胞存活率=(轉染組A490值/對照組A490值)×100%，實驗重復3次，取均值。

六、統計學處理

結 果

一、DCs的形態變化、表面標志及抗原遞呈能力

培養第5天，細胞多懸浮生長并聚集成團(圖1a)，但結合較松散，輕吹打即可分散漂浮，漂浮細胞邊緣呈毛茸狀(圖1b)；電鏡下見胞體表面粗糙，向四周伸出大量樹枝狀或裙褶狀不規則突起，部分突起末端呈球狀膨大(圖1c)，培養第10天，胞核染色深，偏向一側，形狀不規則，分葉狀，具有典型的DC形態特征(圖1d)。健康志愿者與胰腺癌患者MCs培養形成的DCs在形態方面無明顯差別。成熟DCs的表面標志物CD40、HLA-DR、CD83和CD86均陽性表達(圖2)，陽性表達率分別為34.3%、50.2%、89.2%和73.6%。成熟DCs具有極高的抗原遞呈能力，對同種異體T淋巴細胞具有極強的刺激增殖作用。健康志愿者與胰腺癌患者DCs的刺激同種異體T細胞增殖的能力無顯著性差異(P>0.05，圖3)。

圖1體外培養的健康志愿者和胰腺癌患者外周血DCs細胞的光鏡(a、b)和電鏡觀察(c、d)

圖2體外培養的健康志愿者和胰腺癌患者外周血成熟DCs細胞表面標志物的表達

二、MiaPaCa-2細胞總RNA轉染后DCs的MUC1 mRNA表達

轉染后24、48 h DCs細胞MUC1 mRNA表達水平漸強，72、96 h表達漸弱，組間比較有統計學意義(P<0.05)，其中電轉染的DCs的MUC1 mRNA表達水平較脂質體和被動轉染的DCs強(P<0.05，表1)。

圖3健康志愿者與胰腺癌患者DCs刺激同種異體T細胞增殖的能力

三、DCs存活率

被動轉染法對DCs存活率變化影響最小，且在不同時間點的細胞存活率相差不大；脂質體轉染法對細胞毒性作用較明顯，DCs存活率呈時間依賴性顯著下降；電轉染法對DCs有一定的毒性作用，細胞存活率較被動轉染法低，但不同時間點的細胞存活率變化不大，穩定在80%左右(圖4)。

圖4 三種轉染方法的DCs存活率

討 論

DC腫瘤疫苗作為一種主動免疫的抗腫瘤方法，能夠通過激活自身免疫系統，識別并殺傷腫瘤細胞，并可使機體免疫系統獲得長期監視和預防腫瘤復發的能力[6]。因其對腫瘤細胞的殺傷遵循0級動力學效應，有可能徹底清除腫瘤細胞，被認為是胰腺癌免疫治療中的最具前途的方法之一。

本實驗將GM-CSF、IL-4和TNF-α聯合作用人外周血MCs獲得DCs，無論是健康志愿者還是胰腺癌患者，所獲的目標細胞均具有典型的DC形態學特征，細胞表面有HLA-DR、CD40、CD83和CD86等成熟DCs表面標志物的陽性表達，均具有較強的抗原呈遞能力。

RNA轉染DCs的腫瘤疫苗具有顯著的優點[7]：轉染的RNA只進入DCs胞質而非胞核，對細胞的損傷??；RNA半衰期短，RNA轉染的DC疫苗更為安全；負載的腫瘤抗原可從很少量的癌細胞中經PCR擴增獲得；RNA模板本身可經進一步的序列修飾，穩定性較強。目前常用的以RNA轉染DCs的方法主要有RNA-陽離子脂質體復合物、被動轉染和電穿孔法等。

表1 三種方法轉染的DCs的MUC1 mRNA表達

注：與被動轉染法比較，aP<0.05；與脂質體轉染法比較，bP<0.05；與對照組(0 h)和其他時間點比較，cP<0.05

被動轉染法是將RNA和DCs共孵育，憑借DCs所具有的吞噬能力達到轉染的目的。本實驗采用被動轉染法將MiaPaCa-2細胞總RNA轉染DCs后，胰腺癌相關抗原MUC1弱陽性表達，轉染前后DCs存活率變化不大。提示此法雖對DCs本身的損傷較小，但轉染時間較長，RNA易被降解，轉染率較低。

以陽離子脂質體作為載體轉染DCs是目前應用最多的一種方法。Lu等[8]采用該法轉染乳腺癌細胞系，獲得了報告基因mRNA的高表達。但陽離子脂質體本身具有毒性，且轉染所需時間長。本實驗采用該法轉染的DCs雖有較強的MUC1表達，但DCs存活率下降顯著。明顯的細胞毒性可能會限制其臨床應用。

電穿孔法是一種效率較高的轉染方法，穿孔過程僅需1 s，整個過程僅5 min，故特別適用于半衰期短、易降解的RNA轉染[9-10]。本實驗采用電穿孔法轉染的DCs有較強的MUC1表達，DC表面抗原的表達量明顯高于其他兩種方法，且轉染前后DCs生存率無顯著變化，穩定在80%左右。提示電穿孔法不但轉染效率較高、且較為安全，可能是構建RNA轉染DCs胰腺癌腫瘤疫苗的最優方法。

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2010-07-26)

(本文編輯：屠振興)

OptimizingmethodofpancreaticcancerMiaPaCa-2cellstotalRNA-transfecteddendrticcells

CHENJiang,GUOXiao-zhong.

DepartmentofGastroenterology,GeneralHospitalofShenyangMilitaryCommand,Shenyang110016,China

GUOXiao-zhong,Email:Guoxiaozhong1962@163.com

ObjectiveTo investigate the best method of transfecting total RNA extracted from pancreatic cancer MiaPaCa-2 cells into dendrtic cells (DCs).MethodsDCs were cultured from peripheral blood mononuclear cells induced by rhGM-CSF, rhIL-4 and TNF-α. Morphology of DCs was observed. Flow cytometry was used to detect the mature DCs specific surface markers: CD40, HLA-DR, CD83, CD86. Mixed lymphocyte (MLR) was used to determine the ability of DCs to stimulate allogeneic T cell proliferation. Liposomal transfection, electroporation method and passive transfection was used to transfect MiaPaCa-2 cell total RNA into DCs, Real time RT-PCR and MTT assay was used to determine the expression of MUC1 mRNA and the survival rate of the RNA transfected DCs.ResultsThe cells acquired showed typical DCs morphology, the positive rate of CD40, HLA DR, CD83and CD86were 34.3%,50.2%,89.2%and73.6%, and they showed a strong ability to stimulate allogeneic T cell proliferation. 48 h after transfection with MiaPaCa-2 cells total RNA by using electroporation, the MUC1 mRNA amount (45.39±9.33) in DCs was higher than that of liposomes method (31.68±7.25) and passive transfection method (18.53±3.26)。DCs survival rate was (80.36±2.43)% by using electroporation, which was relatively lower than (91.48±5.42)%by using passive transfection method, but higher than (67.44±2.51)% by using liposomes method, and it was stabilized around 80%.ConclusionsTransfecting total RNA extracted from pancreatic cancer MiaPaCa-2 cells into DCs with electroporation is efficient and safe.

Pancreatic neoplasms； Dendritic cells； RNA Transfection

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.01.008

110016 沈陽，沈陽軍區總醫院消化科

郭曉鐘，Email:Guoxiaozhong1962@163.com