Artemin及其受體GFRα3在胰腺導管癌組織中的表達及意義

孟令新 丁兆軍 陳希平 費立升 張紅 王曉芳

·論著·

Artemin及其受體GFRα3在胰腺導管癌組織中的表達及意義

孟令新 丁兆軍 陳希平 費立升 張紅 王曉芳

目的探討Artemin及其受體GFRα3(glial cell line-derived neurotrophic factor receptor α3)在胰腺導管癌組織中的表達及意義。方法采用免疫組化、PCR、熒光定量RT-PCR和基因測序等方法檢測100例人胰腺導管癌組織標本和40例正常胰腺組織的Artemin、GFRα3表達，分析它們與臨床病理學特征，尤其與嗜神經轉移的關系。結果100例標本中64例存在神經轉移，轉移率為64%。Artemin、GFRα3蛋白在胰腺癌組織中的表達量分別為正常胰腺組織的(2.697±0.231)倍和(2.599±0.588)倍；mRNA的表達量分別為正常胰腺組織的7.01和4.63倍。胰腺癌組織Artemin、GFRα3蛋白表達與腫瘤部位、分化程度、TNM分期、神經侵犯、淋巴結轉移相關(P<0.01)，與患者年齡、性別、腫瘤大小均無關。且靠近神經組織的癌細胞Artemin、GFRα3陽性程度高于遠離神經組織癌細胞。結論Artemin、GFRα3參與胰腺癌的發生，兩者在胰腺癌組織中的高表達和胰腺癌嗜神經性關系密切。

胰腺腫瘤； Artemin； GFRα3； 腫瘤轉移； 疼痛； 嗜神經浸潤

胰腺癌神經轉移率高，且與頑固性腹痛密切相關，但胰腺癌嗜神經性確切分子機制尚不清楚。作為膠質源性神經營養因子(GDNF)家族成員之一，Artemin及其受體GFRα1～4/RET的主要生理功能是促進各種神經性疾病的修復，影響細胞的生長、分化和凋亡，但它們在人胰腺癌組織中的表達及與腫瘤神經轉移的關系研究甚少。本研究檢測Artemin及受體GFRα3在胰腺癌組織中的表達，分析其與腫瘤臨床病理特征的關系，探討其臨床意義。

資料與方法

一、臨床資料

收集日照市人民醫院病理科2001年10月至2009年10月手術切除的胰腺癌組織標本100例，均經病理確診為胰腺導管癌。其中男性57例，女性43例，年齡34～72歲，平均(50±10)歲；按2002年UICC(第6版)胰腺癌TNM分期方法分期，Ⅰ期12例，Ⅱ期35例，Ⅲ期31例，Ⅳ期22例；胰頭癌48例，胰體尾癌52例；術前均未行任何放、化療等治療。正常胰腺標本取自因胃腸道、膽管或膽囊病變行胰十二指腸聯合切除術患者，共40例，男性27例，女性13例，年齡33～68歲，平均(47±9)歲。

二、病理學檢查

胰腺組織常規固定、包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察神經外膜、束膜或內膜下神經周圍間隙有無癌細胞存在和(或)沿神經周圍間隙擴散。神經浸潤類型分為：侵入型(癌細胞侵入神經束膜內)；圍神經型(癌細胞圍繞神經纖維生長)；近神經型(神經組織內見癌細胞，其數量尚不足以圍繞神經組織)；混合型(兩種或兩種以上)[1]。

三、Artemin、GFRα3蛋白檢測

采用常規免疫組化法。SABC免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物工程技術有限公司，抗Artemin、GFRα3單克隆抗體分別購自史瑞可生物(上海)有限公司和北京友誼中聯生物科技有限公司。胞質、胞膜著棕黃色為陽性表達。結果判斷：40×10倍視野下隨機選5個視野，計數著色強度和陽性細胞百分數。著色強度按染色深度分：陰性0分、淺黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分。每例分值按文獻[2]計算，為陽性百分數×著色強度+1。

四、Artemin、GFRα3 mRNA檢測

Trizol(Invitrogen公司)提取標本總RNA，取2 μg總RNA用M-MLV逆轉錄酶(Promega公司)逆轉錄為cDNA。Artemin上游5′-TGGCCGCTCTGG-CTCTGCTGA-3′，下游5′-TGAGGTCTCTGG-TGTCTTTTAGG-3′，產物382 bp；GFRα3上游5′-ATT-GGCACAGTCATGACTCCCAAC-3′，下游5′-GAGGAGCAGCCATTGATTTTGTGG-3′，產物260 bp；內參β-actin上游5′-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3′，下游5′-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3′，產物136 bp。引物均由北京奧科生物技術有限責任公司合成。PCR反應條件：95℃ 2 min，95℃ 30 s，69℃(Artemin)或65℃(GFRα3)或57℃(β-actin)30 s、72℃ 1 min,35個循環，最后72℃ 5 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，回收，送上海基康生物技術有限公司測序。另外，在ABI GeneAmp 5700儀上行實時PCR，反應條件同上。通過儀器所帶軟件獲得相應Ct值。mRNA 表達量通過公式2-△Ct計算，△Ct=Ct目的基因-Ctβ-actin。以正常胰腺組織的mRNA表達量為1，計算胰腺癌mRNA表達的倍數。

五、統計學處理

結 果

一、胰腺癌組織標本神經轉移情況

100例標本中64例存在神經轉移，轉移率為64%，其中侵入型36例，圍神經型12例，近神經型4例，混合型12例(圖1)。

a：侵入型(×200)；b：圍神經型(×400)；c：圍神經組織并侵入神經束膜(×200)；d：近神經型(×200)

圖1胰腺癌的不同類型神經轉移(HE)

二、胰腺癌組織Artemin、GFRα3蛋白表達及其與臨床病理特征的關系

Artemin、GFRα3蛋白陽性物質呈棕黃色顆粒，主要定位于胰腺癌細胞的胞質，胞膜少量著色，部分神經鞘膜呈GFRα3陽性表達(圖2)。Artemin、GFRα3在胰腺癌組織中的表達量分別為正常胰腺組織的(2.697±0.231)倍和(2.599±0.588)倍。在胰腺癌組織中，Artemin與GFRα3的表達呈正相關(r=0.848,P<0.01)。

胰腺癌組織Artemin、GFRα3蛋白表達與腫瘤部位、分化程度、TNM分期、神經侵犯、淋巴結轉移相關(P<0.01)，與患者年齡、性別、腫瘤大小均無關(表1)。此外，靠近神經組織的癌細胞Artemin、GFRα3陽性程度高于遠離神經組織癌細胞。

圖2胰腺癌組織中Artemin(a)、GFRα3(b)表達(SABC ×200)

臨床病理特征例數ArteminGFRα3年齡(歲) <50452.346±0.2392.352±0.482 ≥50552.986±0.2252.801±0.674性別 男572.294±0.4022.447±0.523 女432.958±0.3842.715±0.670腫瘤大小(cm) ≤5362.365±0.3052.453±0.538 >5442.926±0.3422.742±0.623腫瘤部位 頭482.239±0.2642.253±0.692 體尾523.258±0.495a3.318±0.904a分化程度 高分化241.373±0.3121.464±0.537 中分化412.482±0.381a2.561±0.638a 低分化353.719±0.526b3.729±0.742b神經轉移 無361.625±0.2831.836±0.762 有643.643±0.482b3.528±0.641b淋巴結轉移 無461.458±0.4261.248±0.384 有543.729±0.583b3.626±0.643bTNM分期 Ⅰ～Ⅱ期472.163±0.3062.237±0.645 Ⅲ～Ⅳ期533.659±0.726b3.024±0.732a

注：aP<0.05,bP<0.01

三、 Artemin、GFRα3 mRNA的表達

Artemin和GFRα3測序結果見圖3和圖4。應用NCBI Blast 2.2.16:Nucleotide sequence(BLAST Basic Local Alignment Search Tool)進行基因比對， Artemin序列與GenBank提供的定位于染色體1p32～p33區已知序列(N：AF115765)完全一致。GFRα3基因序列與GenBank提供的定位于染色體5q31.2～q32的已知序列(N：AF051767)亦完全一致。

圖3 Artemin基因測序圖(Forward)

圖4 GFRα3基因測序圖(Forward)

在Rn=0.01水平，Artemin、GFRα3 mRNA在胰腺癌組織中表達的數據見表2，癌組織的Artemin、GFRα3 mRNA表達量分別為正常胰腺組織的7.01和4.63倍。

表2 正常及胰腺癌組織細胞中各基因表達的比較

注：△Ct為循環數差值

討 論

Artemin是GDNF 家族最晚被發現的成員，由113個氨基酸和7個保守的半胱氨酸殘基組成。Artemin與neurtuin(NTN)及persephin(PSP)有45%同源性，與GDNF 有大約30%的同源性。Artemin傾向于結合GFRα3受體，形成配基/受體復合物，通過糖基-磷脂酰肌醇(GPI) 錨定于細胞質膜，激活Ret，從而傳遞信號。在胚胎發育中，腎、胃腸道、神經系統、軟骨和肌肉細胞高水平表達Artemin。Artemin亦廣泛表達于多種腫瘤組織中，參與腫瘤發生、發展。文獻報道[3]，GDNF可通過增加金屬蛋白酶9的活性而促進胰腺癌細胞的侵襲性。體外實驗證明[4]，將表達GDNF mRNA 并分泌GDNF的惡性膠質瘤細胞系與胰腺癌細胞系共同培養，胰腺癌細胞向膠質和神經性腫瘤細胞遷移能力大幅提高，且這種遷移與GDNF 的濃度明顯相關，用抗GDNF 抗體干預可明顯減弱這種遷移作用。神經轉移與臨床分期、淋巴管浸潤密切相關，造成頑固性腹痛，嚴重影響生活質量[5-6]。

Ito等[7]報道，Artermin在胰內神經叢高表達。Ceyhan等[8]研究發現，Artemin和GFRα3/Ret主要定位于原發灶及轉移灶癌細胞、神經束和動脈壁上，在胰腺導管癌中的表達比正常胰腺組織明顯增加。Artemin的高表達可增加癌細胞的浸潤侵襲能力高達5倍，但與胰腺癌性疼痛無相關性。

本實驗結果顯示，胰腺導管癌組織的神經浸潤率高達64%。Artemin、GFRα3的mRNA和蛋白的表達在胰腺癌中明顯高于正常胰腺組織，提示它們參與胰腺癌發生。Artemin表達在有神經浸潤組明顯高于無神經浸潤組，且靠近神經組織的癌細胞陽性程度高于遠離神經組織的癌細胞，提示Artemin與胰腺癌神經轉移關系密切。而胰體尾部癌Artemin表達水平明顯高于胰頭癌，部分解釋了臨床上胰體尾癌患者往往以腹部疼痛為主訴的原因。此外，Artemin表達水平與癌細胞分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關，提示它有可能作為預測預后的靶標之一。在胰腺癌組織中，GFRα3與Artemin表達呈正相關，推測由胰腺癌細胞分泌的Artemin，一方面可能通過旁分泌途徑，與神經鞘膜上的GFRα3受體結合，作用于神經細胞，為神經細胞軸突的生長提供適宜的微環境和化學趨化性，促進神經軸突向腫瘤方向生長，進而造成癌細胞侵犯神經纖維；另一方面，可能通過自分泌途徑，作用于癌細胞自身表面的GFRα3受體，通過Artemin-GFRα3生物軸系統，激活細胞內信號轉導通路，促進癌細胞增殖。

[1] 徐東波，孫保存.腺樣囊性癌的臨床病理分析及神經浸潤機制研究.2006年中國博士學位論文全文數據庫，2006，57．

[2] Zhigang Z,Wenlv S.Prostate stem cell antigen (PSCA) expression in human prostate cancer tissues:implications for prostate carcinogenesis and progression of prostate cancer.Jpn J Clin Oncol,2006,36:121.

[3] Funahashi H,Takeyama H,Sawai H,et al.Alteration of integrin expression by glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in human pancreatic cancer cells.Pancreas,2003,27:190-196.

[4] Bockman DE,Buchler M,Beger HG.Interation of pancreatic ductal carcinoma with nerve damage.Gastroenterology,1994,107:219-230.

[5] Hirai I,Kimura W,Ozawa K,et al.Perineural invasion in pancreatic cancer.Pancreas,2002,24:15-25.

[6] 程鵬,金鋼,胡先貴,等.新生淋巴管在胰腺導管腺癌周圍神經叢微轉移過程中的機制研究.中華胰腺病雜志,2009,9:363-366.

[7] Ito Y, Okada Y, Sato M,et al.Expression of glial cell line-derived neurotrophic factor family members and their receptors in pancreatic cancers.Surgery,2005,138:788-794.

[8] Ceyhan GO,Giese NA,Erkan M,et al.The neurotrophic factor artemin promotes pancreatic cancer invasion.Ann Surg,2006,244:274-281.

2010-01-20)

(本文編輯：屠振興)

ExpressionandsignificanceofarteminanditsreceptorsGFRα3inpancreaticductaladenocarcinoma

MENGLing-xin,DINGZhao-jun,CHENXi-ping,FEILi-sheng,ZHANGHong,WANGXiao-fang.

DepartmentofOncological,RizhaoPeopleHospital,JiningMedicalCollege;RizhaoCancerTherapyCenter,Rizhao276826,China

MENGLing-xin,Email:menglx001623@163.com

ObjectiveTo investigate artemin and its receptors GFRα3 expression in human pancreatic ductal adenocarcinoma and its significance.MethodsExpression and distribution of artemin and GFRα3 in 100 cases of human pancreatic ductal adenocarcinoma(PDAC) and 40 cases of normal pancreatic tissue were detected by immunohistochemistry and RT-PCR, quantitative RT PCR. Relations of artemin and GFRα3 with clinicopathological characteristics, especially nerve invasion were analyzed.ResultsNerve invasion was detected in 64 out of 100 cases of PDAC, and the rate of nerve invasion was 64%. The ratio of expression of Artemin, GFRα3 protein in PDAC/ normal pancreatic tissue was 2.697±0.231 and 2.599±0.588; the ratio of expression of Artemin, GFRα3 mRNA was 7.01 and 4.63. Artemin and GFRα3 expression were associated with tumor location, differentiation degree, TNM staging, nerve invasion node metastasis, but it was not associated with age, sex and tumor size. Artemin and GFRα3 expression was more positively expressed in cancer cells close to nerve tissue than cells far from nerve tissue.ConclusionsArtemin and GFRα3 were involved in the development of pancreatic cancer and their high expression was closely related to perineural invasion.

Pancreatic neoplasms; Artemin; GFRα3; Neoplasm metastasis; Pain; Perineural invasion

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.06.009

山東省自然科學基金(ZR2010 HL053)

276826 山東省日照市,濟寧醫學院附屬日照市人民醫院腫瘤科，日照市腫瘤治療中心(孟令新、丁兆軍、陳希平、費立升、張紅);天津醫科大學附屬腫瘤醫院國家“211工程”中心實驗室(王曉芳)

孟令新,Email:menglx001623@163.com