原位注射法建立人胰腺癌SW1990裸鼠種植瘤模型及高頻內鏡超聲探頭對其的監測

馬建霞 司佩任 吳洪玉 王洛偉 潘雪 高軍 李兆申 金震東

·論著·

原位注射法建立人胰腺癌SW1990裸鼠種植瘤模型及高頻內鏡超聲探頭對其的監測

馬建霞 司佩任 吳洪玉 王洛偉 潘雪 高軍 李兆申 金震東

目的建立裸小鼠人胰腺癌原位種植瘤模型，探索監測種植瘤生長的方法。方法將對數生長期的人胰腺癌細胞株SW1990制備成細胞懸液，原位注射于Balb/c-nu裸小鼠胰腺尾部包膜下,利用高頻內鏡超聲(EUS)探頭體表觀察腫瘤結節的生長及聲像圖像。結果20只裸小鼠均接種成功，1只裸鼠于接種后25 d時死亡。接種后14 d，EUS檢查的瘤體大小為(8.09±2.61)mm3，腫瘤結節呈均質低回聲,邊界清楚,周邊有包膜及聲暈,形態規則，30%的腫瘤結節周邊可見低速環繞彩色血流信號；接種后28 d，瘤體增大至(12.40±3.51)mm3,70%的腫瘤結節呈不規則形,部分為分葉狀,腫塊呈低回聲,不均質,未見液化壞死區，70%的腫瘤結節周邊可見低速環繞彩色血流信號。結論原位注射法是建立裸小鼠人胰腺癌原位種植瘤模型較理想的方法，操作簡便，成瘤率高；高頻內鏡超聲顯像是可靠的監測胰腺原位種植瘤的手段。

胰腺腫瘤； 模型，動物； 內鏡超聲檢查

裸鼠胰腺原位癌模型與人的胰腺癌自然病程一致，而且其腫瘤微環境與人胰腺癌相似，成為胰腺癌實驗研究中最常用的動物模型之一。如何更加方便、高效地建立模型，并實時監測裸小鼠胰腺腫瘤的生長成為裸鼠模型成功的研究重點。以往常通過手術方式在胰腺原位種植裸鼠皮下移植瘤組織塊的方法。但該法對外科技術要求高，腫瘤組織塊可能脫落入腹腔造成腹腔種植。為此，本實驗采用原位注射人胰腺癌細胞懸液的方法建立裸鼠胰腺癌原位模型,并采用高頻內鏡超聲探頭監測其生長規律及聲像圖特征。

資料與方法

一、實驗動物、試劑及儀器

人胰腺癌細胞株SW1990購自美國ATCC公司，常規培養于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 ng/ml鏈霉素的DMEM培養液,每2 d換液，3～4 d傳代。20只4～6周齡雄性Balb/c-nu裸鼠，體重18～20 g，購自中科院動物中心，獲國家動物品系合格證，于第二軍醫大學動物中心SPF(specific-pathogen free)級分籠飼養。DMEM細胞培養基、L-谷氨酰胺、二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶為北京天來公司產品，胎牛血清為PAA Laboratories GmbH產品。超聲探頭為Olympus環形掃描超聲內鏡GF-UE260-α5的75Hz的高頻探頭。

二、模型制備及監測

取對數生長期SW1990細胞，稀釋成1×107/ml細胞懸液。裸鼠麻醉后取右側位，常規消毒鋪巾后剖腹，暴露胰腺尾部，于胰腺尾部包膜下接種0.2 ml細胞懸液(圖1a)。術后自由飲水、進食。每日記錄裸鼠的一般情況，觀察有無手術并發癥，稱體重。接種14 d及28 d對裸鼠進行超聲觀測(圖1b)。觀察前將超聲儀和檢查探頭用1%醋酸洗必泰液搽洗1次,檢查室用紫外線燈照射2 h,檢查時穿無菌隔離衣。將裸鼠麻醉后置于無菌水中，內鏡超聲探頭水囊充滿，貼近裸鼠腹壁，觀察腫瘤二維聲像圖及彩色血流信號，測量腫瘤長、寬、厚三個徑線,每個徑線均測3次,取平均值,腫瘤體積V=π/6×長×寬×厚。

三、病理學檢查

接種后28 d,處死裸鼠,取腫瘤組織及肝臟、肺臟、腹膜等組織，常規行病理學檢查。

結 果

一、裸鼠一般狀況

20只裸鼠接種后7 d飲水、進食正常，以后逐漸開始出現納差，活動力減弱，28 d后均出現消瘦、惡液質等表現。接種后25 d有1只裸鼠死亡，解剖后發現死于胰腺癌腹腔種植，并發腸梗阻。荷瘤鼠在7、14、21、28 d的平均體重分別為19.2、20.5、18.7、17.0 g。

二、超聲觀察結果

20只裸小鼠均接種成功。接種后14 d，超聲檢查裸鼠胰腺原位均形成瘤結節，大小為(8.09±2.61)mm3，呈均質低回聲,邊界清楚,周邊有包膜及聲暈,形態規則，30%的腫瘤結節周邊可見低速環繞彩色血流信號。接種后28 d，瘤體增大至(12.40±3.51)mm3,70%的腫瘤結節呈不規則形,部分為分葉狀,腫塊呈低回聲,不均質,未見液化壞死區，70%的腫瘤結節周邊可見低速環繞彩色血流信號(圖2)。

圖1胰腺原位注射SW1990細胞(a)及裸小鼠胰腺種植瘤的內鏡超聲探頭檢查(b)

圖2 接種后14 d(a)和28 d(b)裸鼠種植瘤的超聲圖像

三、種植瘤的病理改變

處死時有3只裸鼠可見血性腹水。胰腺原位腫瘤呈多個灰白色或灰黃色結節、質硬，類圓形、分葉狀或結節狀(圖3a)。光鏡下見腫瘤細胞排列紊亂、分化差、核深染,每高倍視野可見核分裂象8～10個,組織內偶見導管及腺泡,可見較多血管腔,并可見微血管，周圍胰腺組織正常(圖3b)。肺臟均未見轉移灶。一只裸鼠肝臟出現轉移灶。

圖3裸鼠種植胰腺癌的大體標本(a)及病理改變(b，HE ×200)

討 論

動物模型是腫瘤實驗研究的基礎，由于裸鼠缺乏胸腺，不具備T細胞免疫力，故對異種移植不產生排斥反應，成活率高[1]，因此，裸鼠是最多用來建立腫瘤模型的動物。裸鼠胰腺癌移植瘤動物模型制備方法主要有三種：人胰腺癌細胞裸鼠皮下種植模型、脾內注射肝轉移模型和外科胰腺原位種植模型。

皮下種植腫瘤成功率高,具有易于治療和觀察療效的優點，但皮下瘤與人的胰腺癌自然病程不一致，且轉移灶的腫瘤生物學特性可以與原發灶不同[2]。原位種植法是采用直接來自新鮮外科標本或裸鼠皮下移植瘤組織，通過原位種植于裸鼠胰腺內建立胰腺腫瘤模型。由于原位種植，腫瘤可維持癌細胞來源的組織結構和其生物學特性，在宿主體內以更類似于人類的方式顯示其惡性行為。但在胰腺包膜下接種組織塊難度較大，容易造成出血、胰瘺

以及組織塊脫落等并發癥，且手術費時，裸鼠死亡率較高。

1995年Alisaukus等[3]采用原位注射皮下瘤塊組織液的方法建立胰腺癌模型，但依然費時。本文采用于胰腺原位直接注射培養的胰腺癌細胞懸液，成瘤率達100%，并發癥低，死亡率5%，效果理想。

為監測腫瘤生長情況，通常使用高場強磁共振及臨床性線圈急性掃描[4]，耗時長，成本高。我們曾采用超聲探頭對裸鼠胰腺種植瘤進行監測，但因普通探頭過大，頻率低，無法對裸鼠這種超小型動物腹腔內腫瘤進行很好地觀察，所以我們改用了內鏡超聲的高頻超聲探頭，結果能清晰地顯示荷瘤裸小鼠的胰腺癌結節聲像圖，且能獲得血流信號，為種植瘤提供更多的信息，是一種較理想的監測腫瘤生長的手段。

[1] 孟令新，李強，郭仁德，等．裸鼠胰腺癌動物模型及其應用進展．中華實驗外科雜志，2006，23：1583-1584．

[2] Schuetz JD,Schuetz EG.Extracellular matrix regulation of multidrug resistance in primary monolayer culture of adult rat hepatocytes．Cell Growth Differ,1993,4：31-40．

[3] Alisauskus R,Wong GY,Gold DV.Initial studies of monoclonal antibody PAM4 targeting to xenografted orthotopic pancreatic cancer.Cancer Res,1995,55：5743s-5748s．

[4] 何偉，王冬青，孫維斌，等.人胰腺癌細胞株PANC1裸鼠原位模型的建立及磁共振監測.中華胰腺病雜志,2009,9:328-330.

2011-01-13)

(本文編輯：呂芳萍)

Establishoftheorthotopichumanpancreaticcancermodelinmiceandhighfrequencyprobeofendoscopyultrasonographicmonitoring

MAJian-xia,SIPei-ren,WUHong-yu,WANGLuo-wei,PANXue,GAOJun,LIZhao-shen,JINZhen-dong.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

JINZhen-dong,Email:zhendjin@126.com

ObjectiveTo establish the orthotopic human pancreatic cancer model in mice and study the method to detect the tumor growth.MethodsHuman pancreatic cancer cell lines SW1990 in logarithmic phase was made into cell suspension and in situ injected into the envelope of pancreatic tail of BALB/c nude mice. High-frequency endoscopy ultrasound was used to observe the growth of tumor mass and its imaging characteristics were studied.Results20 nude mice were successfully implanted, and 1 died 25 h after implantation. 14 days after implantation, the tumor of pancreatic cancer on EUS was(8.09±2.61)mm3, the tumor appeared as homogeneous hypoechoic mass with clear boundary, and envelope as well as sound halo was present, and the shape was regular; there was low speed circular vasculature signal in around 30% of tumor. The tumor size increased to (12.40±3.51)mm3, and the shape of 70% tumor was irregular, and some appeared as lobulated, and the tumor appeared as heterogeneous hypoechoic mass, no necrosis or liquefaction was found 28 days after implantation. There was low speed circular vasculature signal in around 70% tumors.ConclusionsThe orthotopic pancreatic cancer model in nude mouse can be established by in situ injection and this method is relatively ideal because it is simple and effective. The high frequency probe of endoscopic ultrasonograph is a reliable method for monitoring implanted pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms; Model, animal; Endoscopy Ultrasonography

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.01.013

國家自然科學基金(C171006)

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

金震東，Email:zhendjin@126.com