巨噬細胞因子daintain激活血液炎癥反應

趙燕英，汪俊漢，陳正望

1西南民族大學生命科學與技術學院，成都610041;2華中科技大學生命科學與技術學院; 3華中科技大學校醫院，武漢430074

巨噬細胞因子daintain激活血液炎癥反應

趙燕英1，2*，汪俊漢3，陳正望2

1西南民族大學生命科學與技術學院，成都610041;2華中科技大學生命科學與技術學院;3華中科技大學校醫院，武漢430074

Daintain是我們鑒定并命名的巨噬細胞炎癥因子。多個小組的研究表明daintain與炎癥密切相關，但截至目前尚缺乏兩者關聯的直接證據。本實驗研究了daintain對昆明鼠血液C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)和纖維蛋白原的影響，結果表明daintain促進血液CRP的增高，激活纖維蛋白原，此外還觀察到daintain增加了血液粘度并加速血液凝固。這些結果提示daintain可直接激發血管炎癥反應，可能促進心血管疾病的發生。

daintain;C反應蛋白;纖維蛋白原;炎癥

炎癥是具有血管系統的活體組織對損傷因子所發生的防御反應。通常情況下，炎癥是有益的，是人體的自動應激反應，但是有的時候，炎癥也是有害的，例如對人體自身組織的攻擊、發生在透明組織的炎癥等［1，2］。血管反應是炎癥過程的中心環節。

二十世紀90年代中期，我們在研究胃腸多肽激素對胰腺β細胞分泌影響的時候，從豬小腸中分離鑒定出了一個蛋白，命名為daintain(Da，大big;in，炎癥 inflammatory;tai，肽 peptide;in，因子 factor)［3，4］，不同小組研究表明細胞因子干擾素γ可上調其轉錄水平，daintain是巨噬細胞激活過程中的一個免疫調節器［5］;daintain對于巨噬細胞的存活和前炎癥(pro-inflammatory)活力至關重要［6］;而抑制daintain的表達減弱了動脈粥樣硬化刺激的巨噬細胞的遷移、增生和信號轉導［7］。這些研究都顯示了daintain與炎癥的密切關系。但尚缺乏daintain促進炎癥反應的直接證據。本文擬探討daintain在血管中對炎癥反應的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料

10周齡昆明鼠購自湖北省實驗動物中心，丙烯酰胺、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺、SDS、過硫酸胺、TEMED、溴酚蘭、考馬斯亮藍R-250、β-2-巰基乙醇均購自Bio-Rad公司，NC膜購自Millipore公司，化學發光劑購自Pierce，辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG二抗購自Santa Cruz公司，蛋白電泳儀轉膜系統購自Bio-Rad公司。

臨床化學分析儀CL-8000S購自日本HIMADZU公司，纖維蛋白原由Sysmex株式會社CA系列全自動凝血分析儀檢測，纖維蛋白原檢測試劑盒購自德國Dade Behirng公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 daintain純化和鑒定

按照先前報道的方法［2］純化daintain。主要過程包括組織切碎、高溫滅活蛋白酶、稀醋酸浸提、海藻酸吸附、NaCl鹽析、異丙醇分級提取、Sephadex G25凝膠過濾、DEAE纖維素離子交換層析和多次高效液相色譜法純化。將純化組分經12%SDSPAGE分離，考馬斯亮藍染色;另外電泳樣品進行轉膜和封閉后，依次經過 daintain單克隆抗體［8］(1∶1000)、辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG二抗(1∶5000)孵育以及化學發光劑顯影和定影，鑒定純化組分。

1.2.2 C反應蛋白和纖維蛋白原檢測

將18只昆明鼠隨機分為兩組，每組9只，其中一組靜脈注射溶于生理鹽水的daintain，劑量為5 μg/g體重，對照組注射相同體積生理鹽水。30 h后對昆明鼠心臟取血，枸櫞酸鈉抗凝，生化分析儀檢測血液中C反應蛋白水平，全自動凝血分析儀檢測纖維蛋白原。

1.2.3 統計分析

2 實驗結果和討論

2.1 實驗結果

2.1.1 Daintain純化鑒定

高效液相色譜分離后的蛋白組分經過 SDSPAGE后，其分子量介于14.4～18.4 kDa之間初步符合daintain(17 kD)的分子量大小(如圖1所示，其中1為蛋白分子量標準，2為純化樣品)。

圖1 純化組分的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE of purified aliquot

將純化的蛋白組分與daintain單克隆抗體孵育后，其可與daintain抗體發生特異性結合，說明純化組分為daintain蛋白(如圖2，圖中斑點為純化組分與daintain抗體特異性結合斑點)。

圖2 純化組分的western blot圖譜Fig.2 Western blot of purified aliquot

2.1.2 C反應蛋白和纖維蛋白原檢測

昆明鼠靜脈注射daintain后，其血液中C反應蛋白平均值為2.32±0.47 mg/L，濃度高于對照組C反應蛋白平均值(0.90±0.46 mg/L)，差異顯著(P＜0.05)結果見圖3。

圖3 daintain對血液C反應蛋白水平的影響Fig.3 Assays of C-reactive protein in the blood

而注射daintain后的昆明鼠血漿纖維蛋白原的平均值為1.36±0.15 g/L，顯著高于對照組纖維蛋白原平均水平(0.89±0.16 g/L)(P＜0.05)，結果見圖4。

圖4 daintain對血液纖維蛋白原濃度的影響Fig.4 Assays of fibrinogen in the blood

在檢測注射daintain鼠血漿C反應蛋白和纖維蛋白原升高的同時，取血時，在沒有抗凝劑存在的情況下，注射daintain組昆明鼠血液粘度增加且血凝時間縮短。

2.2 討論

C反應蛋白是炎癥標志物，具有激活補體和加強吞噬細胞吞噬的作用。在發熱性疾病、各種炎癥狀態和創傷時，血液中C反應蛋白水平會明顯增高，C反應蛋白的檢測作為炎癥和組織損傷的非特異性標志物大量應用于臨床［9］。本實驗中巨噬細胞因子 daintain促進 C反應蛋白水平升高，說明daintain可直接激起炎癥反應的發生。同時也部分解釋了其他小組所報道的daintain激活巨噬細胞，對其遷移增生非常必要［6，7］。

纖維蛋白原是除C反應蛋白外另一種急性時相蛋白，是發生炎癥反應的另一指標。其主要生理功能是作為凝血因子I直接參與體內凝血過程。研究發現纖維蛋白原含量升高有促進心血管病發生的作用［10］。我們的實驗顯示daintain激活了纖維蛋白原，也確實觀察到daintain增加了血液粘度，促進了血液凝固，暗示了daintain可能會促進心血管疾病的發生。

心血管疾病的病理基礎是動脈粥樣硬化。由于炎癥在動脈粥樣硬化病理過程的各個階段中均發揮著主導作用［11］，因此，包括C反應蛋白和纖維蛋白原在內的重要炎癥因子在動脈粥樣硬化風險預測及致病機理中作用的研究，獲得了廣泛關注［12］。本實驗中daintain激活了C反應蛋白和纖維蛋白原。因此，daintain可能在動脈粥樣硬化發生發展中扮演一定的角色。圍繞這一主題，后續研究可從daintain對免疫細胞的激活和泡沫細胞的形成等方面開展。

1 Moore K.Cell biology of chronic wounds:the role of inflammation.J Wound Care，1999(8):345-348.

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3 Chen ZW.Isolation and structural analysis of a novel peptide daintain.Eur J Endocrinol(abstr.)，1994，30，(Suppl)2: 32.

4 Chen ZW，Ahren B，?stenson CG，et al.Identification，isolation，and characterization of daintain(allograft inflammatory factor 1)，a macrophage polypeptide with effects on insulin secretion and abundantly present in the pancreas of pre-diabetic BB rats.Proc Natl Acad Sci USA，1997(94):13879-13884.

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6 Yang ZF，Ho DW，Lau CK，et al.Allograft inflammatory factor-1(AIF-1)is crucial for the survival and pro-inflammatory activity of macrophages.Int Immunol，2005(17):1391-1397.

7 Tian Y，Kelemen SE and Autieri MV.Am inhibition of AIF-1 expression by constitutive siRNA expression reduces macrophage migration，proliferation，and signal transduction initiated by atherogenic stimuli.Am J Physiol Cell Physiol，2006 (290):C1083-C1091.

8 Fu K，Zhao YY，Tang WX，et al.Preparation and identification of monoclonal antibodies against daintain.Hybridoma，2006(25):95-97.

9 Pepys MB and Hirschfield GM.C-reactive protein:a critical update.J Clin Invest，2003(111):1805-1812.

10 Renata R，Ma?gorzata K，Beata KW，et al.Fibrinogen--acute phase protein as a marker of immunological process as atherosclerosis.Folia Med Cracov，2005(46):21-32.

11 Russ R.Atherosclerosis-an inflammatory disease.N Engl J Med，1999(340):115-126.

12 Ridker PM，Stampfer MJ，Rifai N.Novel risk factors for systemic atherosclerosis:a comparison of C-reactive protein，fibrinogen，homocysteine lipoprotein(a)，and standard cholesterol screening as predictors of peripheral arterial disease. JAMA，2001(285):2481-2485.

Macrophage Cytokine Daintain Stimulates Inflammatory Reaction in the Blood

ZHAO Yan-ying1，2*，WANG Jun-han3，CHEN Zheng-wang21College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China;2School of Life Science and Technology，Huazhong University of Science and Technology;3Huazhong University of Science and Technology Hospital，Wuhan 430074，China

Daintain is a macrophage inflammatory factor characterized by us.There is an intimate relationship between daintain and inflammation without direct evidence by now.In the present study，we demonstrated that daintain increases the level of C-reactive protein(CRP)and actives fibrinogen in the blood with higher blood viscosity and faster blood coagulation.The results indicated that daintain invokes inflammatory reactions in the blood directly，suggesting that daintain may be involved in cardiovascular disease.

daintain;CRP;fibrinogen;inflammation

1001-6880(2011)03-0425-03

2011-04-07 接受日期:2011-05-11

國家“863”高技術研究發展計劃(2002AA214061)，國家自然科學基金項目(30370647、30470823)

*通訊作者 E-mail:biozyy@163.com

R284.2

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