HPLC-ELSD法測定家桑野桑植株中1-脫氧野尻霉素的含量

宋 婕，鄧潔麗，周光雄

暨南大學藥學院中藥及天然藥物研究所廣東省高校中藥藥效物質基礎與創新藥物研究重點實驗室，廣州510632

HPLC-ELSD法測定家桑野桑植株中1-脫氧野尻霉素的含量

宋 婕，鄧潔麗，周光雄*

暨南大學藥學院中藥及天然藥物研究所廣東省高校中藥藥效物質基礎與創新藥物研究重點實驗室，廣州510632

采用HPLC-ELSD法對桑植株各部位所含的1-脫氧野尻霉素(DNJ)進行了含量測定，使用TSKgel Amide-80(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，流動相為:乙腈-水(84∶16，6.5 mM醋酸銨)，流速為1.00 mL/min，柱溫:30℃，線性范圍為0.505 μg～20.2 μg(r=0.9991，n=6)，平均回收率為94.95%(n=5)，RSD=1.98。測定結果表明，野桑葉、嫩枝和根皮部位的DNJ含量較高，而家桑的葉、枝皮和根皮中含量較高。本方法準確度高、重現性好，能快速檢測桑樹資源及類似植物和相關產品中1-脫氧野尻霉素的含量。

1-脫氧野尻霉素;高效液相色譜法;蒸發光散射檢測器;桑

桑是我國廣泛栽植的經濟作物，并且有悠久的用藥歷史。歷代醫學古籍都有記載可用桑葉治療消渴癥，現代藥理研究表明桑葉具有降血糖的作用，其降血糖活性成分為多羥基生物堿［1］，其中主要成分為1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，簡稱DNJ)，化學名稱為3，4，5-三羥基-2羥甲基四氫吡啶。DNJ因結構與糖非常類似，能夠競爭性的抑制二糖與α-葡萄糖苷酶的結合，阻止麥芽糖、異麥芽糖、蔗糖等二糖水解為單糖被人體吸收，從而明顯降低餐后血糖濃度峰值。DNJ對所有哺乳動物的α-葡萄糖苷酶均有抑制作用［2］，能用于治療II型糖尿病、肥胖癥等疾病，并且還具有抗病毒及抗HIV病毒、抗腫瘤轉移等作用［3-5］，高效低毒，有優越的保健食用及藥用價值。而桑的許多部位中均含有DNJ，Yoshiaki等已首次從桑枝及桑白皮中分離出DNJ［6］，Asano等也從桑葉和桑葚中分離出DNJ［7］。我國桑樹種類繁多，分布廣，各地栽培條件及地理氣候不同，為了能快速檢測桑樹各個部位中的DNJ含量，以便對不同產區、品種桑資源的DNJ含量進行分析，使桑樹資源得到合理、有效和充分利用，為DNJ產業化應用提供參考，需要建立桑樹資源中DNJ含量的測定方法。已有研究人員用HPLC-ESD法分別測定了不同產地的桑葉中DNJ的含量［8］，不同地區桑白皮中DNJ的含量［9］，本文中使用HPLC-ELSD法，改進了提取方法和液相條件，使得DNJ提取較完全且雜質峰大大減少，對不同品種桑的不同部位、不同產地的桑樹資源以及不同采集期得到的桑葉中的DNJ含量均進行了測定和綜合分析。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器

美國Agilent1200高效液相色譜儀:G1329A自動控溫進樣器，G1311A四元泵，G1316A柱溫箱; Allchrom plus色譜工作站，美國Alltech ELSD-2000蒸發光散射檢測器。

1.2 試劑

乙腈為色譜純;732強酸性陽離子樹脂為廣東時美樹脂廠產品;醋酸銨、氨水均為分析純;水為雙重蒸餾水;DNJ為實驗室自制(純度大于98%)。

1.3 材料

野桑樣品為暨南大學周光雄教授從安徽省績溪縣采集并經鑒定為野桑品種中的雞桑(Morus australis)Poir.家桑為白桑(Morus alba L.)。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱:TSKgel Amide-80(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相:乙腈-水(84∶16，v/v)，水中含6.5 mM醋酸銨;流速:1.00 mL/min;柱溫:30℃;ELSD漂移管溫度:55℃，載氣流速:3.2 L/min。進樣量10 μL。將對照品及樣品按上述色譜條件進行測定，隨行外標兩點法計算含量。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取粉碎至80～100目的桑葉粉末1 g，加入50%乙醇水100 mL，加熱回流提取2次，每次2 h，兩次提取液過濾合并，旋蒸至無醇味。提取液經過732強酸性陽離子樹脂柱處理，用0.5 N氨水洗脫。洗脫液濃縮，過濾，移至5 mL容量瓶，用去離子水定容至刻度，作為供試品溶液，保存在4℃冰箱，臨用時經微孔濾膜(0.45 μm)過濾后進樣。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取DNJ對照品10.10 mg，去離子水溶解，定容至10 mL，搖勻，得1.01 mg/mL對照品溶液。對照品波譜數據:ESI-MS m/z:164.3［M+ H］+，162.5［M-H］-;1H NMR(400 MHz，D2O)δ: 3.87(1H，dd，J=11.6，2.9 Hz，H-2'a)，3.68(1H，dd，J=11.7，6.2 Hz，H-2'b)，3.54(1H，ddd，J= 10.8，9.0，5.1 Hz，H-5)，3.36(1H，t，J=9.0 Hz，H-4)，3.28(1H，t，J=9.4 Hz，H-3)，3.17(1H，dd，J= 12.3，5.2 Hz，H-6e)，2.60(1H，ddd，J=9.4，6.2，3.0 Hz，H-2)，2.51(1H，t，J=11.6 Hz，H-6a);13C NMR(100 MHz，D2O)δ:60.0(d，C-2)，60.9(t，C-2')，71.0(d，C-3)，77.9(d，C-4)，70.4(d，C-5)，48.2(t，C-6).

2.4 標準曲線的建立

取DNJ對照品溶液，分別進樣0.5、0.8、2.5、4.0、12.5和20 μL，依照上述色譜條件測定。以峰面積的對數作為縱坐標，以進樣量的對數作為橫坐標，進行線性回歸，回歸方程為:y=1.3325x+ 5.4437(r=0.9991，n=6)。結果表明，DNJ在0.505 μg～20.2 μg范圍內呈現良好的線性關系。按5倍噪音計算檢測限為0.303 μg/mL。

2.5 精密度試驗

在色譜條件不變的情況下，將DNJ對照品溶液連續進樣五針，每次進樣10 μL，考察儀器的精密度，計算峰面積RSD。

2.6 穩定性實驗

取同一份桑葉的供試品溶液(野桑1號葉，記為WML-1)分別在第0、5、10、15、20、30日進樣，每次進樣10 μL，按上述色譜條件測定，考察其穩定性。

2.7 重現性實驗

依照供試品溶液制備方法平行制備5份WML-1供試品溶液，分別進樣10 μL，按上述色譜條件并隨行外標兩點法測定WML-1中DNJ的含量。

2.8 加樣回收率實驗

精密稱取5份已知含量的WML-1粉末約1 g，分別加入2.14 mg/mL的DNJ對照品溶液1 mL，按2.2項供試品溶液制備方法制備溶液，再按上述色譜條件測定含量。

2.9 樣品測定:

取野桑植株1號中的葉、枝皮、枝木質部、嫩枝(一年生)、根皮、根木質部粉末;野桑植株2號中的老根根皮(三年以上)、根木質部粉末;野桑植株3號中的葉、枝皮、嫩枝木質部、嫩莖、老莖木質部(兩年以上)、根皮粉末;家桑植株1號中的葉、枝皮、枝木質部粉末;家桑植株2號中的枝、枝皮粉末;家桑植株3號中的枝皮和枝木質部，根皮和根木質部粉末分別進行測定，另外還對不同產地的桑椹、桑白皮和桑葉(白桑，M.alba)粉末以及不同時間采集的桑葉(白桑，M.alba)粉末，按2.2項供試品溶液制備方法制備，再分別進行測定。

3 實驗結果與討論

3.1 實驗結果

3.1.1 對照品及樣品色譜圖

3.1.2 精密度

根據實驗結果計算峰面積RSD為1.77%。

3.1.3 穩定性

圖1 DNJ對照品色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of DNJ

圖2 樣品WML-1譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of WML-1

測定結果表明在4℃條件下保存，樣品在30天內穩定，峰面積RSD=3.73%(n=6)。

3.1.4 重現性

測得WML-1中DNJ平均含量為0.2316%，RSD=1.24%(n=5)，結果表明本方法重現性良好。

3.1.5 加樣回收率

結果見表1，測得樣品加樣回收率的平均值為94.55%，RSD=1.99%(n=5)。

表1 DNJ的加樣回收率Table 1 Recovery rate of DNJ

3.1.6 樣品測定結果

結果見表2～5。

表2 野桑資源的DNJ含量Table 2 The content of DNJ in wild mulberry(M.australis)resouces

3號 葉 1 8 7 2 7 8 6 1 0 . 3 0 1 0枝皮 2 4 9 0 4 0 3 0 . 0 7 4 0嫩莖 3 1 0 1 4 9 4 0 . 0 8 6 2嫩枝木質部 9 9 4 6 5 7 0 . 0 3 9 0老莖木質部 無明顯峰 ＜0 . 0 1 5 0根皮5 0 8 0 6 7 3 0 . 1 2 1 5

表3 家桑資源的DNJ含量Table 3 The DNJ content of culture mulberry(M.alba)resources

2號 枝皮 2 2 4 3 6 3 2 0 . 0 7 3 4全枝 1 6 7 5 1 7 3 0 . 0 5 9 8 3號 枝皮 5 6 2 2 2 4 1 0 . 1 3 8 0枝木質部 無明顯峰 ＜0 . 0 1 5 0根皮 8 9 2 0 3 2 9 0 . 1 4 3 9根木質部3 3 3 9 7 8 0 0 . 0 7 2 2

表4 不同產地桑葚、桑白皮、桑葉的DNJ含量Table 4 The DNJ content of mulberry fruit，mulberry root bark，and mulberry leaves

表5 不同時間采集的桑葉(M.alba)的DNJ含量Table 5 The DNJ content of mulberry leaves(M.alba)in different collecting time

3.2 討論

DNJ結構中沒有共軛基團，難以通過紫外檢測器檢測。目前常用質譜鑒定［10，11］，檢測方法有硅烷衍生化后GC-MS檢測［12］、柱前熒光衍生化-高效液相熒光或紫外檢測［13，14］，以及紅外光譜 IR或ELSD［15，16］檢測，也有人使用高效陽離子交換色譜-脈沖安培檢測法(HPCEC-IPAD)［17］。但是硅烷化和衍生化方法操作步驟繁瑣、誤差較大;RI檢測器則靈敏度有限、專一性差;離子色譜儀不是一般實驗室常用設備，且使用此方法DNJ出峰時間過早，故使用ELSD為較佳選擇。

試驗曾嘗試用超聲提取法提取，但是對于桑枝、根木質部含纖維較多的部位則提取不完全，故采用加熱回流提取，提取兩次為宜。對提取溶劑也進行了篩選，分別用50%甲醇水、50%乙醇水、50%乙腈水對藥材進行提取，結果表明，用50%乙醇水提取的DNJ含量較高。且提取物經陽離子交換樹脂純化后，雜質峰大大減少，峰型也較好。

植物韌皮部的篩管輸送葉產生的有機物質，而木質部的導管則輸送從根部吸收的水、無機鹽等物質，理論上DNJ在桑枝韌皮部的含量應該比木質部高。從實驗結果看，家桑的枝皮中DNJ含量比其木質部高，但是在野桑中，枝木質部的DNJ含量比枝皮的高，對于家桑與野桑中枝皮與枝木質部DNJ含量高低相反的情況，還需進一步實驗研究。無論家桑中與野桑，DNJ在根皮中的含量普遍比根木質部高，在莖皮及莖木質部中含量都較低，葉及根皮的DNJ含量比較穩定。根據不同地區產的桑葉、桑白皮、桑椹中DNJ含量來看，平均氣溫較高，雨水較充分的地方，DNJ含量也較多。中藥學中通常認為經霜后的桑葉藥用為佳，本實驗中對同一植株上不同時間連續采集的桑葉進行測定，其DNJ含量呈現波動，其變化可能受氣候條件變化影響。對于DNJ含量與桑樹的種類、不同部位以及氣候、地域影響含量的確切關系，還需進一步研究。

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Determine the Content of 1-Deoxynojirimycin in Mulberry Resources by HPLC-ELSD

SONG Jie，DENG Jie-li，ZHOU Guang-xiong*
Guangdong Province Key Laboratory of Pharmacodynamic Constituents of Traditional Chinese Medicine and New Drugs Research，Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural Products，College of Pharmacy，Jinan University，Guangzhou 510632，China

The content of 1-deoxynojirimycin(DNJ)in mulberry resources was determined by HPLC with an evaporative light scattering detector(ELSD).The HPLC method was established using TSKgel Amide-80(4.6 mm×250 mm，5 μm)column with acetonitrile-water(84∶16 containing 6.5 mM ammonium acetate)as mobile phase.The flow rate was 1.00 mL/min，column temperature 30℃.The standard curve for DNJ using ELSD was linear in the range of 0.505 μg～20.2 μg，r=0.9991(n=6).The average recovery was 94.95%(n=5)，RSD=1.98%.The results showed that the contents of DNJ in mulberry leaves，root barks，and twigs were higher than other parts of Morus australis.And the contents of DNJ in mulberry leaves，branch bark，and root barks were higher than other parts of M.alba.The method was accurate and reproducible.It could be used for the rapid determination of DNJ in mulberry resources and other related products.

1-deoxynojirimycin;HPLC;ELSD;mulberry

1001-6880(2011)03-0490-05

2010-09-27 接受日期:2011-03-11

廣東省教育部產學研結合項目(2009B090600117)

*通訊作者 Tel:86-20-85221469;E-mail:guangxzh@sina.com

Q946.91;R284.1

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