四種五加果實(shí)的活性成分的HPLC定量比較分析

馮 勝，劉向前，2*，朱曉東，鄭禮勝

1中南大學(xué)制藥工程系，長(zhǎng)沙410083;2湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)沙410208

四種五加果實(shí)的活性成分的HPLC定量比較分析

馮 勝1，劉向前1，2*，朱曉東1，鄭禮勝1

1中南大學(xué)制藥工程系，長(zhǎng)沙410083;2湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)沙410208

首次系統(tǒng)地對(duì)短梗五加、糙葉五加、藤五加、窄葉藤五加四種五加屬植物果實(shí)中的金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、山奈素、6，7-二甲氧基香豆素、紫丁香苷等6種活性成分進(jìn)行了含量比較。采用RP-HPLC測(cè)定各個(gè)活性成分的含量。色譜柱為ODS C18柱，各活性成分的含量測(cè)定均選擇最優(yōu)的色譜條件和供試品溶液制備方法。結(jié)果顯示:糙葉五加，藤五加，窄葉藤五加果實(shí)中除紫丁香苷外的其他活性成分含量均高于短梗五加，但尚未得到有效利用，具有相當(dāng)好的開(kāi)發(fā)前景。

五加屬植物;黃酮類;6，7-二甲氧基香豆素;紫丁香苷;HPLC

五加科(Araliaceae)五加屬(Acanthopanax Miq.)植物全世界分布約有37種，主要分布于亞洲的中國(guó)、韓國(guó)和日本。我國(guó)分布有26種18變種，占世界首位，其中短梗五加、糙葉五加、藤五加、窄葉藤五加均為常見(jiàn)品種。韓國(guó)已發(fā)現(xiàn)五加屬植物17種(11種3變種3變型)，日本也已發(fā)現(xiàn)五加屬植物9種［1］。其根皮大都為民間常用藥材，俗稱“五加皮”，始載于我國(guó)《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品［2］。其性溫，味辛、苦，歸肝、腎經(jīng)，具有祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、通淤血、利水腫、鎮(zhèn)痛解熱等功效，中日韓三國(guó)的藥典均有記載。

由于五加屬植物的良好食藥用價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景，受到廣泛關(guān)注［3］。研究表明五加屬植物果實(shí)中的黃酮類物質(zhì)、香豆素類物質(zhì)、紫丁香苷等為其主要活性成分，是具有廣泛生物活性的植物功效成分，但迄今未見(jiàn)對(duì)五加屬植物果實(shí)中的黃酮類和香豆素類物質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)研究的報(bào)道。本研究首次采用RPHPLC對(duì)4種五加屬植物(短梗五加、糙葉五加、藤五加和窄葉藤五加)中的主要黃酮類成分(金絲桃苷、蘆丁、槲皮素和山奈素)和6，7-二甲氧基香豆素、紫丁香苷的含量進(jìn)行測(cè)定，以期為五加屬植物果實(shí)的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Agilent 1100 Speries高效液相色譜儀(日本島津公司);SPD-10A紫外檢測(cè)器(日本島津公司); CBM-102自動(dòng)進(jìn)樣器(日本島津公司);LC-10AT雙泵(日本島津公司);AUW120D高精度電子天平(日本島津公司);AS3120A超聲波清洗器(天津奧特塞恩斯儀器有限公司);DZF-6020型真空干燥箱(上海金鵬分析儀器有限公司)。

金絲桃苷對(duì)照品、蘆丁對(duì)照品、槲皮素對(duì)照品、山奈素對(duì)照品、6，7-二甲氧基香豆素對(duì)照品、紫丁香苷對(duì)照品均購(gòu)于湖南省藥檢所;甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、四氫呋喃、三氯甲烷、鹽酸、磷酸、冰醋酸均為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);水為雙蒸水。

實(shí)驗(yàn)用4種五加果實(shí)經(jīng)韓國(guó)慶熙大學(xué)陸昌洙教授鑒定為短梗五加A.sessiliflorus(Rupr.et Maxim.) Seem(遼寧丹東)、窄葉藤五加A.leucorhizus var.scaberulus(Harms et Rehd)(湖南新化)、糙葉五加A.henryi(Oliv.)Harms(湖南新化)、藤五加A.leucorhizus(Oliv.)Harms(湖南新化)，標(biāo)本存于中南大學(xué)制藥工程系標(biāo)本室(標(biāo)本號(hào):094～097)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

六種活性物質(zhì)HPLC含量測(cè)定的色譜條件［4-9］，如表1所示:

表1 六種活性物質(zhì)含量測(cè)定的色譜條件Table 1 Chromatographic conditions of Quantitative comparison of six kinds of active substances

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備

六種活性物質(zhì)HPLC含量測(cè)定的對(duì)照品溶液制備方法［10］，如表2所示:

表2 對(duì)照品溶液配制方法Table 2 The preparation method of reference substance solution

1.2.3 供試品溶液的制備

六種活性物質(zhì)HPLC含量測(cè)定的供試品溶液制備方法［4-9］，如表3所示:

表3 供試品溶液配制方法Table 3 The preparation method of solution for the test product

蘆丁R u t i n 取干燥后的四種五加藥材，粉碎，精密稱定約1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入5 0 m L甲醇稱定重量，超聲處理4 5 m i n，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，微孔濾膜過(guò)濾，即得。槲皮素Q u e r c e t i n山奈素K a e m p f e r i d e取干燥后的四種五加藥材，粉碎，精密稱定約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入8 0 %甲醇，密塞，稱定重量，加熱回流1.5 h，放冷;再稱定重量，用8 0 %甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取濾液2 5 m L，精密加入2 5 %鹽酸7 m L，置8 5℃水浴中水解3 0 m i n，取出，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至5 0 m L容量瓶中，并加甲醇稀釋至刻度，搖勻微孔濾膜過(guò)濾，即得。取干燥后的四種五加藥材，粉碎，精密稱定約1.0 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷回流提取2 h，棄去溶劑，藥渣揮干，加甲醇回流提取4 h，提取液蒸干，殘?jiān)蛹状?2 5 %鹽酸溶液( 4∶1 )混合液2 5 m L，加熱回流3 0 m i n，放冷，轉(zhuǎn)移至5 0 m L量瓶中，并加甲醇至刻度，搖勻，即得。6，7 -二甲氧基香豆素6，7 -D i m e t h y l e s c u l e t i n取干燥后的四種五加藥材，粉碎，精密稱定約1.0 g，置于錐形瓶中，加入5 m L蒸餾水浸潤(rùn)，放置過(guò)夜，加入三氯甲烷1 0 0 m L，超聲提取3 0 m i n，震蕩3 0 m i n，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)眉状既芙猓^(guò)0.4 5 μ m微孔濾膜，用甲醇定容于1 0 m L量瓶中，即得。紫丁香苷S y r i n g o s i d e 取干燥后的四種五加粉末約0.5 g，精密加入甲醇2 0 m L，稱重，記錄重量，浸1 2 h后，超聲處理( 2 5 k w，3 6 k H z ) 3 0 m i n，靜置至室溫，補(bǔ)足重量，過(guò)濾后取續(xù)濾液備用，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果分析

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

由于蘆丁、槲皮素和山奈素的檢測(cè)方法來(lái)源于中國(guó)藥典［11-13］，故僅對(duì)金絲桃苷、6，7-二甲氧基香豆素、紫丁香苷進(jìn)行方法學(xué)考察。選用短梗五加果實(shí)為研究精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及加樣回收率試驗(yàn)的樣品。

精密吸取短梗五加果實(shí)對(duì)照品溶液4、8、12、16、20 μL進(jìn)樣，以峰面積積分值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量B為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得三種活性物質(zhì)回歸方程分別為:

金絲桃苷:Y=8461.3X+83238，r2=0.9991 6，7-二甲氧基香豆素:Y=2029.1X-21781，r2= 0.9997

紫丁香苷:Y=15234.6X-7881.8，r2=0.9999

表明金絲桃苷在0.3168～1.8304 μg/mL，6，7-二甲氧基香豆素在0.00466～0.0466 mg/mL，紫丁香苷在0.0148～0.074 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，在1.2.1項(xiàng)色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD;測(cè)得金絲桃苷，6，7-二甲氧基香豆素，紫丁香苷的RSD分別為0.61%，0.30%，0.52%。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別在0、3、6、9、12、24 h測(cè)定峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，測(cè)得金絲桃苷峰面積值的RSD為1.48%，6，7-二甲氧基香豆素峰面積值的RSD為0.77%，紫丁香苷峰面積值的RSD為3.25%，說(shuō)明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批短梗五加果實(shí)粉末5份，分別按樣品測(cè)定方法操作，測(cè)定峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD;測(cè)得金絲桃苷的RSD為1.50%，6，7-二甲氧基香豆素的RSD為3.38%，紫丁香苷的RSD為2.25%。

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取一定量已知含量的樣品，精密加入一定量金絲桃苷、6，7-二甲氧基香豆素、紫丁香苷對(duì)照品，按樣品含量測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定，測(cè)得金絲桃苷、6，7-二甲氧基香豆素、紫丁香苷平均回收率分別為97.61%、99.60%、98.25%，RSD分別為1.55%、1.03%、0.96%，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)Table 4 Recoveries of syringin at various spiked amounts(n=5)

6，7 -二甲氧基香豆素6，7 -D i m e t h y l e s c u l e t i n 1 1.7 0 0.0 5 0.1 6 0.2 1 9 9.8 4 2 1.7 4 0.0 5 0.1 6 0.2 1 9 9.4 0 9 9.6 0紫丁香苷S y r i n g o s i d e 1 0.3 6 0.0 2 0.1 5 0.1 6 9 4.8 6 2 0.3 4 0.0 2 0.1 5 0.1 7 1 0 0.8 1 3 0.3 3 0.0 2 0.1 5 0.1 6 9 8.0 4 4 0.3 5 0.0 2 0.1 5 0.1 7 1 0 1.0 8 9 8.2 4 1.7 4 0.0 5 0.1 6 0.2 2 1 0 0.6 6 3 1.7 0 0.0 5 0.1 6 0.2 1 9 9.0 9 4 1.6 9 0.0 5 0.1 6 0.2 1 9 9.0 1 5 5 0.3 6 0.0 2 0.1 5 0.1 6 9 6.4 2

2.1.6 樣品測(cè)定

精密吸取供試品溶液10 μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，外標(biāo)法計(jì)算含量。圖1～圖6分別為四種五加中金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、山奈素、6，7-二甲氧基香豆素、紫丁香苷含量測(cè)定的液相色譜圖。

根據(jù)HPLC檢測(cè)結(jié)果，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各成分的含量，結(jié)果如表5所示。

2.2 討論

2.2.1 色譜條件及供試品制備方法的優(yōu)化

根據(jù)05版中國(guó)藥典一部［9］和文獻(xiàn)［10-12］，以基線漂移小，各色譜峰的高度合適，分離效果好，且能得到較多的峰信息為判定標(biāo)準(zhǔn)，選擇了六種活性物質(zhì)的測(cè)定波長(zhǎng)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表5 四種五加果實(shí)中的主要活性成分含量Table 5 The contents of primary active ingredient in the fruit of four species of Acanthopanax Miq.

本文對(duì)色譜條件和供試品制備方法進(jìn)行了探索［10-14］，比較了流動(dòng)相組成和配比在測(cè)定四種五加果實(shí)中六種活性物質(zhì)含量時(shí)對(duì)色譜峰分離度的影響，以及供試品制備方法對(duì)四種五加中六種活性物質(zhì)測(cè)定含量的影響。通過(guò)反復(fù)摸索，分別確定了四種五加果實(shí)中的金絲桃苷［10］，6，7-二甲氧基香豆素［11］，紫丁香苷［12］的最優(yōu)色譜條件及供試品制備方法，而蘆丁，槲皮素，山奈素在05版中國(guó)藥典的方法下，具有最好的色譜峰分離度和最準(zhǔn)確的含量［6-8］。

2.2.2 四種五加果實(shí)的活性成分含量比較

對(duì)比表5中的數(shù)據(jù)，得到:

金絲桃苷含量:窄葉藤五加＞糙葉五加＞藤五加＞短梗五加;

蘆丁含量:藤五加＞窄葉藤五加＞糙葉五加＞短梗五加;

槲皮素含量:藤五加＞窄葉藤五加＞糙葉五加＞短梗五加;

山奈素含量:糙葉五加＞窄葉藤五加＞藤五加＞短梗五加;

6，7-二甲氧基香豆素含量:窄葉藤五加＞藤五加＞糙葉五加＞短梗五加;

紫丁香苷含量:糙葉五加＞短梗五加＞藤五加＞窄葉藤五加。

比較四種五加果實(shí)中黃酮類物質(zhì)的含量，窄葉藤五加中各種黃酮類物質(zhì)的含量均較高。藤五加中除山奈素的含量相對(duì)較低以外，其他黃酮類物質(zhì)均有較高的含量。糙葉五加的山奈素和金絲桃苷含量較高，其他黃酮類物質(zhì)也有一定的含量。短梗五加的各種黃酮類物質(zhì)含量均為最低。

比較四種五加果實(shí)中6，7-二甲氧基香豆素的含量，窄葉藤五加中6，7-二甲氧基香豆素含量最高，藤五加次之，糙葉五加和短梗五加中的含量相對(duì)較低。

比較四種五加果實(shí)中紫丁香苷的含量，糙葉五加中的紫丁香苷含量最高，短梗五加也有較高的含量，而藤五加和窄葉藤五加中的含量較低。

3 結(jié)論

黃酮類物質(zhì)，6，7-二甲氧基香豆素，紫丁香苷作為五加屬植物果實(shí)中的主要有效成分，具有良好的抗疲勞、抗衰老作用，并能明顯地提高耐缺氧能力，同時(shí)具有促進(jìn)腺發(fā)育、止血等療效［14］。通過(guò)對(duì)研究結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，若開(kāi)發(fā)五加果實(shí)中的黃酮類物質(zhì)，窄葉藤五加和藤五加最好，糙葉五加次之;若開(kāi)發(fā)五加果實(shí)中的6，7-二甲氧基香豆素，窄葉藤五加最佳，其他均可;若開(kāi)發(fā)五加果實(shí)中的紫丁香苷，則以糙葉五加和短梗五加為佳。

我國(guó)東北地區(qū)特有的短梗五加已通過(guò)衛(wèi)生部新資源食品批準(zhǔn)，可廣泛應(yīng)用于制藥和食品等行業(yè)，其果實(shí)現(xiàn)已用于飲料類、酒類的生產(chǎn);而糙葉五加、藤五加、窄葉藤五加則尚未得到有效利用。由于糙葉五加、藤五加、窄葉藤五加的果實(shí)與短梗五加的果實(shí)相比，同樣含有大量的活性成分，在多數(shù)活性成分的含量上甚至超過(guò)了短梗五加，這三種五加的果實(shí)將在食品和藥品領(lǐng)域擁有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和巨大的應(yīng)用前景。

1 Ni N(倪娜)，Liu XQ(劉向前).Advances in studies on plants of Acanthopanax Miq.in Araliaceae.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2006，37:1895-1900.

2 Li LL(李麗麗)，Zheng LS(鄭禮勝)，Liu XQ(劉向前)，et al.Analysis of syringin content in new resource Acanthopanax.sessiliflorus(Rupr.et Maxim.)seem and other seven species of Acanthopanax Miq.by RP-HPLC.Food Sci(食品科學(xué))，2009，30(10):140-143.

3 Zhang P(張鵬)，Zheng JP(鄭金萍)，Sun BJ(孫寶俊)，et al.The series product processes the craft of Acanthopanax Sessiliflorus.Acad Period Farm Prod Proc(農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊)2006，3:66-67.

4 National Pharmacopoeia Committee.The People's Republic of China Pharmacopoeia:1(中華人民共和國(guó)藥典:一部).2005，Appendix IXH.

5Yang ZF(楊志芳)，Wang WN(王維娜)，Yang K(楊坤)，et al.Determination of hyperoside，isoquerditrin and quercitrin-3'-glucoside in flos Abelmoschus manihot of different areas by HPLC.Pharm J Chin PLA(解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào))，2005，21:388-393.

6 He FY(何方奕)，Han Y(韓瑩)，Liu M(劉曼).Determination of the contents of total coumarin and 6，7-dimethoxycoumarin in fruit of Acanthopanax sessiliflorum(Rupr.et Maxim.)Seem..J Shenyang Pharm Univ(沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào))，2006，1(23):18-20.

7 Zhang CX(張崇禧)，Zhang YY(張瑩瑩)，Tian X(田芯)，et al.Determination of syringoside in Acanthopanax of different areas by HPLC.Chin Tradit Patent Med(中成藥)，2008，30:1648-1651.

8 Jin XQ(靳曉秋)，Chen L(陳黎).Determination of hyperoside，quercetin and kaempferide in Eupatorium lindleyanum DC.by HPLC.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2008，39: 1254-1255.

9 Liu JF(劉軍峰)，Gao JC(高錦成)，Liu JF(劉建峰)，et al.Determination of syringoside in Acanthopanax obovatus Hoo by HPLC.Northwest Pharm J(西北藥學(xué)雜志)，2008，23:358-359.

10 Yu SL(于世林).High performance Liquid Chromatography and Its Application(高效液相色譜法及應(yīng)用).2 version.Beijing:Chemical Industry Press，2003.

11 National Pharmacopoeia Committee.The People's Republic of China Pharmacopoeia:1(中華人民共和國(guó)藥典:一部).2005，36-37.

12 National Pharmacopoeia Committee.The People's Republic of China Pharmacopoeia:1(中華人民共和國(guó)藥典:一部).2005，84.

13 National Pharmacopoeia Committee.The People's Republic of China Pharmacopoeia:1(中華人民共和國(guó)藥典:一部).2005，220-221.

14 Xu F(徐峰)，Zhao JY(趙江燕)，Liu TS(劉天碩).Analysis of anti-fatigue effect of Acanthopanax.Food Sci(食品科學(xué))，2005，26:453-456.

Quantitative Analysis Comparison of Primary Active Ingredients in Four Species of Acanthopanax Miq.by HPLC

FENG Sheng1，LIU Xiang-qian1，2*，ZHU Xiao-dong1，ZHENG Li-sheng11Department of Pharmaceutical Engineering，Central South University，Changsha 410083，China;2Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China

For the first time，the study compared the contents of active ingredient，which include hyperin，rutin，quercetin，kaempferide，6，7-dimethylesculetin，and syringoside，from 4 species of Acanthopanax Miq.such as A.sessiliflorus (Rupr.et Maxim.)Seem，A.leucorhizus var.scaberulus(Harms et Rehd)，A.henryi(Oliv.)Harms，A.leucorhizus (Oliv.)Harms by RP-HPLC.The column was ODS C18.Best chromatographic conditions and preparation methods of Solution for test were used to analysis every active ingredient.The results showed that the contents of primary active ingredients in other three plants were more than those of primary active ingredients A.sessiliflorus(Rupr.et Maxim.)Seem except for syringoside，but has not yet been effective used.

Acanthopanax Miq.;flavones;6，7-dimethylesculetin;syringoside;HPLC

1001-6880(2011)03-0498-07

2009-10-19 接受日期:2010-04-21

河南省教育廳產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目(09CY020);教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金(教外司留［2005］55號(hào))和中大研究生創(chuàng)新項(xiàng)目(2009SSXT046)

*通訊作者 E-mail:lxq0001cn@163.com

r284.1;Q946.8

A