誘變選育脂肪酶高產菌株及其酶學性質

鄧 欣，方 真*，張 帆，，龍運多，曾虹燕

1中國科學院西雙版納熱帶植物園昆明分部生物能源組，昆明650223;2湘潭大學化工學院，湘潭411105

誘變選育脂肪酶高產菌株及其酶學性質

鄧 欣1，方 真1*，張 帆1，2，龍運多1，曾虹燕2

1中國科學院西雙版納熱帶植物園昆明分部生物能源組，昆明650223;2湘潭大學化工學院，湘潭411105

面包干酵母(Saccharomyces cerevisiae)為出發菌株，對其進行紫外和微波復合誘變，得高產突變菌株DX213，高產突變菌株酶活力為635 U/mL，為出發菌株的1.69倍。菌株富集培養5代，遺傳性狀穩定。DX213菌株的最優產脂肪酶條件為:培養溫度30℃和培養液pH 7.5。酶學性質研究表明:脂肪酶的最適溫度40℃、最適pH為7.5、脂肪酶在40℃以下穩定。Fe3+離子對脂肪酶有激活效應，當Fe3+離子濃度為0.03 g/mL時，脂肪酶酶活力高達720 U/mL。

微波;菌株;活性;面包干酵母;誘變

生物柴油作為石化燃料油的重要替代品，具有可再生、易降解、含硫量低和有害物質排放量小等優點，屬環境友好型燃料。以植物油、動物油和廢食用油等為原料與低碳醇(甲醇、乙醇、正丁醇等)進行酯交換反應，產物即為生物柴油(脂肪酸甲酯)，副產物為甘油［1-6］。發展生物柴油，原料是關鍵。一般來說，植物油的價格占生物柴油生產成本的70%～80%。中國人口眾多，采用菜子油、大豆油、向日葵油等可食用油為原料制備生物柴油是不可行的，小桐子油不可食用但它與菜子油等可食用油有相似的化學組成，以小桐子油為原料制備生物柴油的應用和推廣正是現階段解決中國能源替代問題的最佳手段［7-11］。中國科學院西雙版納熱帶植物園采用轉基因技術對小桐子進行遺傳改良研究，獲得高產、高油和抗逆的轉基因小桐子優良品種-皺葉黑高桐，并在云貴地區大規模種植，為生物柴油的產業化提供原料。中國科學院西雙版納熱帶植物園生物能源組在自身大量實驗的基礎上，提出超聲波協同固定化脂肪酶催化酯交換反應制備生物柴油新工藝(CN101230320A)［12］，該工藝具有能耗低、條件溫和、生物柴油收率高等優點。本文報道以面包干酵母為出發菌株，經紫外和微波復合誘變，得高產脂肪酸突變菌株DX213及其酶學性質，突變菌株DX213價格低廉，催化效果好，可重復使用，遺傳穩定性好，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號CCTCCM 207082。

1 實驗部分

1.1 菌株與培養基

面包干酵母(Saccharomyces cerevisiae):澳大利亞賓那斯集團(Buns philp＆Company Limited)，所用試劑均為分析純。

斜面培養基(g/L):土豆200.0、蔗糖20.0、瓊脂20.0、pH自然。

復篩培養液(g/L):橄欖油5.0 mL，蛋白胨4.0、(NH4)2SO43.0、K2HPO42.0、Mg2SO4·7H2O 1.0。

平板分離培養基(g/L):蛋白胨10.0、橄欖油10.0 mL、(NH4)2SO40.5、NaCl 1.5、K2HPO40.3、Mg2SO4·7H2O 0.15、瓊脂20.0，pH 7.5。121℃滅菌20 min后冷卻到60℃，加入無菌維多利亞藍(4 mg/100 mL)，倒平板。

1.2 產脂肪酶菌株的生長培養及粗酶液制備

稱取2 g面包干酵母細胞置于100 mL無菌水的三角瓶中，28℃培養2～3 d。接種一環菌懸液于斜面培養基上，30℃培養2～3 d。從斜面培養基上洗脫脂肪酶，置裝有玻璃珠三角瓶中，振蕩25-30 min，使脂肪酶充分分散，離心分離，取上層清液，用磷酸鹽緩沖液調至pH 7，得脂肪酶酶液。

1.3 誘變選育

紫外線誘變:量取酵母菌懸液5 mL，加入無菌培養皿中，以30 W的紫外照射儀于30 cm處照射，設定不同的照射時間為不同的UV處理劑量。紫外線照射后，暗修復2 h。將誘變處理后的脂肪酶懸液作梯度稀釋，各樣品進行活菌計數，并與對照組比較，計算致死率。將目的菌液涂布于平板分離培養基上，30℃培養2～3 d。

微波誘變:以脈沖頻率為2450 MHz的650 W家用微波爐，分別對相同濃度和體積的酵母菌懸液進行輻射處理。每次輻射5 s后使培養皿冷卻，再進行輻射，并將照射時間累計。設定不同的輻射時間為不同的微波處理劑量，計算致死率。將目的菌液涂布于平板分離培養基上，30℃培養2～3 d。

篩選方法:在平板分離培養基，挑取單個誘變后顯色圈直徑大、色深的菌落進行搖瓶富集初篩、復篩。

1.4 出發菌株生長曲線

稱取2 g面包干酵母細胞置于100 mL無菌水的三角瓶中，30℃富集培養，定時取樣抽濾，測濾出液脂肪酶酶活，菌體用去離子水洗滌，冷凍干燥至恒重，得到該菌種的生長曲線。

1.5 酶活力測定

采用經典的橄欖油乳化法測定游離脂肪酶的酶活力，在溫度30℃、pH 7.5條件下每分鐘催化產生1 μmol油酸的酶量定義為一個酶活單位(U)。

2 結果與討論

2.1 誘變育種

2.1.1 出發菌株生長曲線

出發菌株在富集培養液中生產脂肪酶進程見圖1。從圖1可知，出發菌株在較短(12 h)停滯期后，很快進入對數期(12～48 h)，后進入穩定期，生產脂肪酶穩定期為48～72 h，然后進入衰亡期。出發菌株生產脂肪酶出現高峰與酵母生物量進入增長高峰的時間一致，在48 h達酶活力高峰，為375 U/mL。富集培養超過72 h，酶活力逐漸降低。主要是因為菌體進入衰亡期，菌體新陳代謝衰退，酶活性降低之故［13，14］。

圖1 脂肪酶的生長曲線Fig.1 The growth curve of lipase strain

2.1.2 脂肪酶產生菌株誘變選育

為考察最適誘變條件，采用不同的UV和微波誘變劑量對面包酵母進行復合誘變，所得致死率結果見表1和表2。結果表明，UV照射20 s以及微波輻射30 s，面包酵母的致死率達到99%以上。

紫外線誘變:將致死率超過99.0%的照射樣品，經平板分離培養初篩，挑選HC值(水解透明圈與菌落直徑之比)相對較大，顯色圈較深的5株復篩，結果發現正突變株1株，此正突變菌株DX212酶活為465 U/mL，較出發菌株提高了24%，選擇DX212作為出發菌株進行微波誘變。

微波誘變:以同樣篩選方式對微波誘變進行初篩、復篩。獲得一株正突變株DX213，其酶活力達635 U/mL，較DX212提高了36.6%，為出發菌株的1.69倍。

將5 mL DX213菌株于富集培養液中，每48 h轉接一代至5代，每代接種培養測定酶活，結果為(U/mL):625、610、635、645和620，可初步認為該菌株具有較好的遺傳穩定性。

表1 致死率與紫外照射時間Table 1 Effect of UV irradiation time on lethal rate

表2 致死率與微波照射時間Table 2 Effect of microwave irradiation time on lethal rate

2.2 誘變育種

溫度和pH是微生物生存的重要外部環境，也是影響微生物發酵的重要因素，接入5 mL DX213菌株于富集培養液中，120 rpm振蕩培養，對DX213菌株產酶培養溫度和培養液初始pH值進行優化。

2.2.1 培養溫度對菌株產酶的影響

溫度是影響酶活性的重要因素之一，溫度對酶促反應的影響有兩個方面:一方面是當溫度升高時酶促反應速度加快;另一方面由于酶本身是蛋白質，隨著溫度升高逐步變性失活，從而降低酶的反應速度。酶的最適反應溫度是這兩種過程平衡。在pH 7.5下振蕩培養48 h，選取5℃為梯度考察培養溫度對產酶的影響，結果見圖2。溫度在20～30℃時，脂肪酶酶活力顯著增加，培養溫度30℃時，培養液脂肪酶活力最大635 U/mL。溫度超過30℃，酶活力逐漸降低。故最佳培養溫度為30℃。

圖2 溫度對產酶的影響Fig.2 Effect of temperature on lipase production

2.2.2 pH對菌株產酶的影響

pH是影響酶活性的重要因素之一，酶活性的表達與培養液的帶電性有關，培養液帶電性影響酶分子的結構特異性，從而影響了酶的活性。DX213菌株在30℃下不同初始pH值培養液中振蕩培養48 h，測定培養液中的脂肪酶活，結果見圖3。從圖3可知，不同初始pH值培養液的脂肪酶活隨pH值(5～7.5)的增加而增大，其中初始pH值為7.5時，酶活力最大，為630 U/mL。pH值超過7.5時，脂肪酶酶活力顯著降低。因此，最佳產酶pH值為7.5。

圖3 pH對產酶的影響Fig.3 Effect of pH on lipase production

2.3 脂肪酶酶學性質

2.3.1 pH值對酶活的影響

圖4 pH對脂肪酶酶活力的影響Fig.4 Effect of pH on enzymatic activity

取5 mL游離脂肪酶酶液，不同pH值條件下測定脂肪酶酶活，結果見圖4，從圖4知，pH 5.0～7.5時，酶活隨pH值的增加而增大，pH為7.5時，脂肪酶酶活最大，高達645 U/mL。隨pH值繼續增大，脂肪酶活力隨著pH值的升高而降低，可能由于堿條件激活了游離酶蛋白必需基團的電離，酶出現水解、脫氨基和外消旋化等現象，從而降低酶活［15-16］。

2.3.2 溫度對酶活的影響

取5 mL游離脂肪酶酶液，不同溫度條件下測定脂肪酶酶活，結果見圖5，從圖5知，在溫度25～40℃時，酶活力隨溫度的增加而迅速增大，溫度為40℃時脂肪酶酶活力最大650 U/mL。溫度繼續增大，脂肪酶酶活力隨著溫度的升高而降低，可能由于較高溫度脂肪酶蛋白部分變性或結構特異性發生變化，從而降低酶活。

圖5 溫度對脂肪酶酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on enzymatic activity

2.3.3 脂肪酶熱穩定性

圖6 脂肪酶熱穩定性Fig.6 The thermal stability of the lipase

取5 mL游離脂肪酶酶液，在40、45℃和50℃條件下將酶液保溫，每隔10 min取保溫酶液，在pH 7.5磷酸緩沖溶液中，測定脂肪酶活，結果見圖6。40℃保溫90 min時其脂肪酶酶活力保持在600 U/ mL，酶活力損失較少。45℃保溫50 min，其剩余酶活力為原酶活力的63.8%，90 min后剩余酶活力僅為原酶活的40%。50℃下脂肪酶的熱穩定性較差，50 min時其剩余酶活力下降至原酶活力的46.9%，90 min后剩余酶活僅為原酶活的31.5%。結果可知，脂肪酶的熱穩定性一般，在低于40℃溫度下穩定。

2.3.4 激活劑對脂肪酶的影響

添加激活劑如某些金屬離子、多糖、戊醇和表面活性劑于反應環境中可影響酶的氫鍵、靜電作用、疏水作用等，針對不同的酶可用不同的離子或化合物來穩定酶的構象。Fe3+濃度對酶活力的影響見圖7。從圖7可知，當Fe3+濃度較低時，隨著Fe3+濃度的增加，脂肪酶酶活力有較大幅度的提高，Fe3+濃度為0.03 g/mL時，脂肪酶酶活力高達720 U/mL。但當Fe3+濃度繼續增高時，Fe3+對脂肪酶的活性起到抑制的作用，脂肪酶的酶活力反而下降。由此可知，Fe3+濃度為0.03 g/mL時，對游離脂肪酶的激活效應最高。

圖7 Fe3+對脂肪酶酶活力的影響Fig.7 Effect of Fe3+concentration on enzymatic activity

3 結論

3.1 面包干酵母為出發菌株，對其進行紫外和微波復合誘變，得高產突變菌株DX213，高產突變菌株酶活力為635 U/mL，為出發菌株的1.69倍。菌株連續培養5代，遺傳性狀穩定。

3.2 DX213菌株的最優產脂肪酶條件為:培養溫度30℃和培養液pH 7.5。

3.3 脂肪酶的最適溫度40℃、最適pH為7.5、脂肪酶在40℃以下穩定。Fe3+離子對脂肪酶有激活效應，當Fe3+離子濃度為0.03 g/mL時，脂肪酶酶活力高達720 U/mL。

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Mutation Breeding of High-yield Lipase Strain and Properties of Lipase

DENG Xin1，FANG Zhen1*，ZHANG Fan1，2，LONG Yun-duo1，ZENG Hong-yan21Biomass group，Xishuangbanna tropical botanical garden，Chinese academy of sciences，Kunming 650223，China;2School of chemical engineering，Xiangtan University，Xiangtan 411105，China

The mutation strain DX213 was obtained by UV and microwave treatment from Saccharomyces cerevisiae.Its enzymatic activity was 635U/mL，enhanced by 69%.The genetic characters were stable after enrichment culture for five generations.The optimal conditions for producing lipase were culture temperature of 30℃ and pH of 7.5.Enzymatic properties were studied and found that the optimal temperature and pH for the lipase were 40℃ and 7.5，respectively. The enzymatic activity kept stable below 40℃.Fe3+had an activating effect on lipase.The enzymatic activity went up to 720 U/mL when the Fe3+concentration was 0.03 g/mL.

microwave;strain;activity;Saccharomyces cerevisiae;mutation

1001-6880(2011)03-0512-05

2010-01-05 接受日期:2010-04-20

國家高技術研究發展計劃資助項目(2003AA214061)，中國科學院知識創新工程重要方向性項目(KSCX2-YW-G-075)

*通訊作者 Tel:86-871-5190637;E-mail:zhenfang@xtbg.ac.cn

TQ645.1;Q814.9

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